不同细胞来源外泌体在骨科退行性疾病中的研究进展

张其琛， 江立波， 李熙雷

复旦大学附属中山医院骨科，上海 200032

随着老龄化问题逐渐加重，骨科退行性疾病的发生率逐渐升高，危害日益增加。其中骨关节炎(osteoarthritis, OA)和椎间盘退变成为全球疾病负担中导致失能生存年(years lived with disability, YLD)的最主要疾病[1]。

为减少手术等传统治疗方法对患者造成的身心负担，研究者从分子医学和生物工程等方面开展了大量工作。其中干细胞疗法被人们寄予厚望，应用胚胎干细胞、间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)、诱导多潜能干细胞(induced pluripotent stem cell, IPSC)等进行软骨和椎间盘修复再生的体外和动物实验均取得了良好的结果[2-4]。

但是，应用干细胞疗法具有细胞泄露、潜在的癌变可能和造成椎间隙和关节腔感染的风险[5]。研究[6-7]表明，包括MSC在内的多种细胞来源的外泌体可促进软骨修复等过程。此外，外泌体还可通过多种生物学方式参与疾病的发生发展。因此，外泌体逐渐成为退行性疾病方向的一大热点。本文主要对不同细胞来源的外泌体在骨科退行性疾病中的研究进展进行综述。

1 外泌体的来源和作用

外泌体是一种具有脂膜结构的直径为30～150 nm的小囊泡，可被多种细胞分泌，并已在血清、乳汁、精液等多种体液中被发现。外泌体与微囊泡、凋亡小体同属细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)。EVs被认为是细胞间交流的重要方式，运输miRNA、脂质和蛋白质，而对接收的细胞产生生物学效应[8]。其中，外泌体可通过核内体来源的多泡体(multivesicular bodies, MVBs)与胞膜融合并发生胞吐作用释放到细胞外，而微囊泡则直接通过细胞膜出芽形成[9]。

凭借携带的内容物和分泌迅速的特性，外泌体不仅可影响受体细胞的表型、细胞迁移、增殖，还可通过分泌出多余或有害的蛋白、脂质、核酸维持亲代细胞的内稳态[10]。外泌体携带的蛋白质包括源细胞非特异性和源细胞特异性2类蛋白分子，其中前者包括和MVBs生成有关的Alix、肿瘤易感基因101(TSG101)、热休克蛋白(Hsp60、Hsp70、Hsp90)和四跨膜蛋白(CD9、CD63、CD81)等，而后者则根据源细胞类型有所不同。其中CD9、CD63、CD81等表面膜蛋白已作为外泌体识别和分选的重要标志物[11]。

2 MSC来源外泌体在骨科退行性疾病中的作用

尽管MSC来源丰富，但对脐带、脂肪组织、骨髓等不同组织来源的MSC的研究[12]发现，其对软骨细胞的营养作用是相似的。与此观察结果相对应，尽管来源不同的MSC外泌体的内容物成分各异，却并不影响其在软骨再生和修复中的作用。

由于MSC外泌体的内容物成分繁多，其具体参与软骨再生及修复的机制仍未完全清楚。但根据目前的研究发现，MSC来源外泌体参与软骨修复、再生的机制主要涉及以下4个方面。

2.1 生物能量学 MSC来源外泌体的内容物中包含丰富的糖酵解ATP，可生成相关酶类，如磷酸葡糖激酶、丙酮酸激酶等。这类酶可使细胞中ATP产量升高、糖酵解介导的合成代谢反应增强，从而改善OA软骨细胞因线粒体功能障碍、ATP不足而导致的软骨细胞炎症、过度凋亡和基质分解代谢增强[13-14]。此外，尽管线粒体氧化磷酸化产生ATP比糖酵解更加高效，OA中软骨细胞糖酵解的水平却提高了10%～100%，足以弥补这种不足。且糖酵解为其他合成步骤提供了代谢中间产物并恢复了受损细胞的氧化还原电位，有助于软骨细胞的损伤修复[15]。

2.2 细胞的增殖与分化 在OA的发展过程中，由于炎症反应的加剧，关节软骨常伴随细胞数量减少，且失去正常的结构与功能。在软骨的修复过程中，间质细胞的增殖和向软骨细胞的分化起到了重要作用[16]。而研究[17]显示，MSC分泌的外泌体可促进软骨细胞增殖而对关节软骨具有相似的修复作用。而一系列细胞增殖与软骨细胞分化信号通路关键分子，如SMAD、AKT和ERK通路等，均受到MSC外泌体中miRNA的密切调控。因此，MSC外泌体所含的150多种miRNA的作用受到越来越多的关注[18]。例如，骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)具有诱导骨膜细胞、MSC向软骨分化的作用。miR92a可与BMP的拮抗基因noggin3作用，正调控软骨生发层的增殖，从而促进人咽软骨的形成[19]。来自miR92a过表达的人MSC的外泌体也被证实可调控WNT5A的活性，增强软骨发生、抑制软骨基质降解[20]。在软骨形成的早期，WNT5A可激活增殖，抑制软骨细胞的分化[21-22]。此外，WNT5A可激活基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)，减少软骨形成后期和成熟软骨细胞中软骨细胞外基质的形成和合成[23]。而另一项研究[24]显示，miR23b可下调人MSC中具有促成骨分化作用的蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)信号通路的活性，促进人MSC向软骨细胞分化。

特异蛋白-1(specificity protein 1，Sp1)是转录因子家族中的一员，具有调节细胞凋亡和增殖的作用[25-26]。研究者[26]发现，Sp1可通过调控小鼠的胶原α1基因，抑制软骨细胞的增殖。转化生长因子-β1(TGF-β1)可刺激MSC外泌体中miR-135b的高表达，并下调Sp1的表达，促进人软骨细胞增殖[27]。

然而，MSC外泌体富含的miRNA中，也有些在软骨修复过程中扮演了负面角色。就如实验[28]观察到，miR145在TGF-β3介导的人MSC向软骨细胞分化中表达下降。随后被证实其通过抑制软骨发生关键转录因子SOX9蛋白水平的表达而在早期软骨分化中起到负面作用。还有一些miRNA则通过调控降解软骨分化过程中起关键作用的调节子的蛋白酶的活性间接影响这一过程。Slug蛋白就是软骨分化中的一种重要负性调节子，其降解受到鼠双微体基因MDM2的调控。而miR221下调MDM2，抑制了Slug的降解，从而阻碍人软骨生发层细胞的增殖[29]。

此外，有体外研究[30]证明，人MSC外泌体也可促进人椎间盘中髓核细胞的增殖，但其具体机制仍不清楚。

2.3 细胞基质的合成与降解 关节软骨的形态和功能是由软骨细胞与其间质共同支持的。细胞外基质主要含Ⅱ型胶原和蛋白聚糖以维持拉力强度和硬度。而在软骨细胞外，还有一层狭窄的基质条带被特称为“细胞周基质”，其富含基底膜聚糖、聚糖蛋白、透明质酸、胶原(以Ⅵ型和Ⅸ型胶原为主)、纤连蛋白。软骨细胞胞膜上的感受器可感受生物化学和生物力学的变化且作为细胞周基质中分子的受体，与之发生联系，以保护软骨细胞适应变化。在OA过程中，软骨细胞与细胞周基质间正常的联系被破坏，通过异常的细胞信号转导，金属蛋白酶MMPs、聚蛋白多糖酶(a disintegrin and metalloproteinase with thrombospondin motifs，ADAMTS)被激活，导致软骨基质的降解[31]。

MSC外泌体中的miRNA可能在抑制软骨ECM降解中发挥着重要作用。miR125b可抑制白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)诱导的人软骨细胞中ADAMTS4的上调[32]。miR320则可下调IL-1β干预的人软骨细胞中MMP13的表达，从而抑制ECM的降解[33]。

此外，体外研究[30]发现，人MSC来源外泌体可被退变的人髓核细胞摄取，抑制其MMP1、3的表达，并改善基质合成情况。

2.4 免疫调节 损伤常伴随着炎症微环境的紊乱，IL-1β、IL-6、IL-8和MMP3等炎性细胞因子上调，加剧了随后的软骨基质降解[34]。而MSC则可通过干扰素IFN-γ、TGF-β1、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、血红素加氧酶-1(hemeoxygenasel，HO-1)、IL-6和前列素E2(prostaglandin E2，PGE2)等物质的协同作用发挥免疫调节作用，从而减轻炎症造成的软骨损伤[35]。

MSC外泌体富含超过200种具有免疫调节作用的蛋白，就使其成为了发挥这种协同作用的良好载体[36]。与此相一致的研究[37]结果表明，MSC外泌体可诱导IL-10和TGF-1β等抗炎因子高表达，并降低人单核巨噬细胞中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α和IL-12p40的表达水平。

此外，研究[38]已证实，补体系统的过度激活在OA发病机制中具有重要作用。而MSC外泌体所富含的CD59则可通过和组成补体攻击复合物的C8、C9结合，阻止MAC介导的细胞溶解，从而阻止OA的发展。

除去上述4个方面，MSC外泌体还可能通过调控细胞程序性死亡而具有对OA和椎间盘退变的潜在治疗应用价值。近期研究[39]发现，MSC外泌体可通过携带的miR-21限制PTEN活性，继而激活PI3K/AKT信号通路，从而抑制髓核细胞的凋亡。

3 软骨细胞外泌体在骨科退行性疾病中的作用

人们对软骨来源外泌体的认识是从关节软骨囊泡(articular cartilage vesicle，ACV)的发现开始的[40]。这类最早发现于OA患者关节软骨内的囊泡直径在50～250 nm，包括微囊泡和外泌体。此外，当时的研究[41]发现，正常软骨来源的ACV与OA软骨ACV内容物的蛋白含量、致矿化能力均有显著差异。后续研究[42-44]证实，OA软骨细胞ACV可形成病理性的钙盐结晶，且其与正常软骨细胞ACV内容物的蛋白质、RNA成分均不同。OA软骨ACV中蛋白聚糖含量下降，而玻连蛋白、发育内皮基因1(developmental endothelial locus-1，DEL-1)、丝氨酸蛋白酶HtrA1的表达上升，与OA患者关节软骨的变化相符。此外，通过ACV进行的细胞物质交流，OA软骨细胞ACV可影响正常细胞的表型，从而加重OA。但目前对ACV中微囊泡和外泌体在上述过程中各自的作用仍未完全阐释清楚。

同样地，人们也在尝试探究正常软骨细胞来源的外泌体对软骨再生和修复的作用。研究人员提取了成熟兔软骨细胞来源的外泌体，并注射到预先植入软骨祖细胞-海藻酸钠移植物的小鼠皮下。体内外研究[45]均证实，软骨来源的外泌体促进了软骨祖细胞的稳定异位软骨形成。这个发现提供了一种合适的软骨生成诱导物，以修复软骨的缺损。

近期研究[46]还发现，正常人软骨细胞与OA软骨细胞分泌的外泌体中miRNA的表达谱有明显差异。通过差异分析，研究者发现OA软骨细胞分泌的外泌体中miR-95-5p水平显著下调。而过表达miR-95-5p的人原代软骨细胞外泌体则可通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDAC)2/8的活性，从而解除其对软骨特异性基因Ⅱ型胶原α1(COL2A1)、蛋白聚糖aggrecan等表达的抑制，并抑制IL-1β、MMPs的表达，从而减少软骨破坏。

有趣的是，软骨细胞外泌体内miRNA的表达谱与其亲本细胞也有明显差异。在该研究[47]亲本细胞和其外泌体所涉及的全部372种miRNA中，有62种在亲本细胞和其外泌体中表达存在差异。在软骨细胞外泌体差异富集的前20种miRNA中，不乏已报道与OA等软骨疾病的发生、发展及软骨再生、修复相关者，提示软骨细胞分泌的外泌体在软骨分化和维持软骨细胞内稳态具有重要作用，见表1。

表1 软骨细胞来源外泌体中miRNA在软骨疾病发生、修复及再生

4 其他细胞来源外泌体在骨科退行性疾病中的作用

在风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)患者的关节囊滑液中，存在着高含量的细胞因子、趋化因子，而滑膜的炎症和新生血管形成与RA和OA的发展均密不可分。在RA患者中，滑膜成纤维细胞(synovial fibroblast, SFB)可通过来自于粒细胞、单核细胞等活化的免疫细胞释放的外泌体调节其炎性物质的释放[52]。类似地，在OA患者中，炎症刺激下的SFB也扮演了加重OA发展的负面角色。据报道[53]，IL-1β刺激的SFB可通过其释放的外泌体在体内外实验中诱导出类似OA的病理表现。

目前髓核细胞外泌体的作用研究甚少。但有报道[30]发现，正常的人髓核细胞外泌体具有促进BMSC迁移和向髓核样细胞分化的作用，提示利用健康髓核细胞外泌体治疗椎间盘退变的潜在价值。

5 外泌体对骨科退行性疾病的应用展望

由于应用MSC对OA患者治疗的结果基本证明了这一方式的安全性，因此推测MSC来源外泌体应具有类似的生物安全性。但是应用MSC来源外泌体的疗效、体内动力学和生物分布特点还有待大型动物和临床试验的研究。此外，应用MSC来源外泌体促进软骨分化、增殖具有新生软骨细胞肥大、血管新生等问题。与之相比，软骨细胞来源外泌体没有类似缺点，并具有同样高效的促软骨分化增殖特点[45]。但软骨细胞外泌体与MSC来源外泌体相比，又具有亲本细胞来源局限、不易大量获得的缺点。这大大制约了其临床应用的前景。此外，对于软骨细胞外泌体参与软骨疾病发生、修复及再生的机制研究远远少于MSC来源外泌体。

综上所述，天然细胞来源外泌体内容物在软骨细胞再生、修复方面具有促进和抑制的两面性[54]。如何通过人工修饰或合成具有类似天然细胞来源外泌体结构、功能的纳米囊泡，将成为未来外泌体疗法走向临床的关键。