液体活检在胃癌诊断中的研究进展

米澜，贺晓花，牟永平

(1.内蒙古医科大学，内蒙古 呼和浩特；2.内蒙古医科大学附属人民医院，内蒙古 呼和浩特)

0 引言

胃癌是一种在我国的发病率和死亡率均处于前十的恶性肿瘤。胃癌的早期诊断对胃癌的诊治以及预后起着至关重要的作用[1]。早期的胃癌诊断以影像学及病理活检为主，影像学的成像技术存在不能用于实时监测肿瘤以及处于辐射暴漏的环境等问题，病理活检则是一种“侵入性”的诊断方法。相比之下，液体活检越来越被认为是胃癌诊断、治疗及实时监测的一种检查手段，其“非侵入式”的检测手段在一定程度上可以替代“侵入性”的传统实体活检。尽管有多的优点，但也存在着一定的局限性或分析困难等问题。本文就液体活检在胃癌诊断中应用的优势以及某些局限性进行简单阐述。

1 实体活检对胃癌的诊断的分析

1.1 “实体活检”概括

相关研究，[2-3]“实体活检”是指利用腔镜或者手术等方法从患者的病变处采取病变组织，最常使用的则是胃镜取材。首先将胃镜插入患者的胃内，通过胃镜观察到病变后，用活检钳从病变处夹取小块组织，然后将病变组织被送到病理科，经过固定、脱水、㓎蜡、包埋、切片、染色等一系列步骤后制成了可以观察的切片，由病理医生在显微镜下进行诊断。判断病变性质。

1.2 “实体活检”的优势

目前病理检查在所有检查方法中准确率最高，被誉为诊断的“金标准”[4]。因此，胃活检，作为一种依靠病理检查的诊断手段，对于胃病的诊断具有很高的准确性和权威性[5]。对其病变组织进行进一步的分析，有利于胃癌及时、准确的诊断。胃癌的分型种类繁多，绝大多数都可以通过“实体活检”的方法检测并区分。

1.3 “实体活检”局限性

“实体活检”是一种创伤性的检查，虽然现在普及了无痛的腔镜技术，但仍然会对患者消化系统粘膜造成一些创伤，在一些重症和老年患者中，腔镜取样仍是一种有创伤的检测手段。

2 “液体活检”与“精准医疗”

1914 年，德国病理学家西奥多·博韦里 (Theodor Boveri)提出癌症发生与遗传有关，认为染色体异常是癌症发生重要原因[6]。2015 年，美国总统奥巴马 “精准医学”的计划，他把癌症列为“精准医学”中的重中之重，希望通过“精准医学”计划来使我们接近治愈癌症。精准医疗和个性化医疗是基于生物标志物的发展[7]。

3 “液体活检”在胃癌中的诊断分析

3.1 “液体活检”概括

19 世纪60 年代，托马斯·阿什沃思在用显微镜进行研究时发现了CTCs 存在于我们的外周血中。自此，肿瘤细胞可以穿透血管壁进入血液的理论进入了大众的视野[8]。“液体活检”指通过分析体液成分，来判断肿瘤的特性，包括基因突变情况，是一种能够检测出携带肿瘤的发展和进展信息的生物标志物[9]。液体活检包括循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell，CTC)、 游 离DNA (Cell-free DNA， cfDNA)，、循 环 肿 瘤DNA(circulating tumor DNA， ctDNA)、外 泌 体(exosome)，、肿瘤血小板(tumor educated platelets， TEPs)等。他可以为肿瘤的早期诊断，病情发展以及治疗疗效提供一个信息，采用一个非侵入式的方法对肿瘤提供一个实时监测。除了完整的肿瘤细胞外，这些细胞的遗传物质也存在于血液循环，以下将针对上文提到的“液体活检”对胃癌诊断的研究进展进行简要地阐述。

3.2 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)对胃癌的诊断分析

3.2.1 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)概述

1869 年，澳大利亚的Ashworth 首次发现CTC 存在于血液循环中，CTC 中极少数的细胞能够在循环系统中存活下来并相互聚集，这就形成了循环肿瘤微栓子(circulating tumor microemboli，CTM)，其可以发展成转移灶，这就造成了一些原发病还未有明显侵袭的情况下就发生了远处转移[10]。部分CTC 可以发生上皮- 间质转化(epithelial mesen- chymal transition，EMT)，这是肿瘤转移的一个重要驱动因素[11]。

CTC 在血液中的含量极微，因此很难估计在几百万个正常细胞中存在单独的肿瘤细胞，人们现在寻找一种技术，以实现最大限度的CTC 富集，然后通过相应技术来检测血中的CTC 含量[12-13]。其中富集CTC 的方法包括阴性捕获法和阳性捕获法，检测方法包括流式细胞检测技术、反转录聚合酶链式反应 (reverse transcription -polymerase chain reaction，RTPCR)等[14]，单一的检测方法仍缺乏一致性，因此现在推崇几种方法的联合检测。CTC 芯片检测技术是一种高效且精密度和灵敏度均高于传统方法的检测方式，通过基因测序的技术，胃肿瘤的诊治提供了精确的信息。

3.2.2 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)在胃癌中的临床研究

乔维洲等人[15]利用CellSearch 系统通过检测胃癌患者外周血中的CTC 含量，研究发现，在胃癌患者术后的24h 内CTC 含量呈下降的趋势；对于Ⅳ期的胃癌患者经过一个疗程的化疗后CTC 含量呈明显的下降趋势；在发生远处转移的胃癌患者中，CTC 阳性患者相较于CTC 阴性的患者预后差。研究表明CTC 的含量与胃癌的复发、转移及治疗效果均有相关性。

Cheng 和Abdallah Emne A 等[16-17]使 用CanPatrol 进 行了CTC 的分离、分类和临床分析，研究发现，上皮细胞CTC 亚群的计数及其在总CTC 库中的相对丰度与临床疗效高度相关。CTC 程序性细胞死亡配体1 (PD-L1)可以成功用于免疫治疗。研究表明与传统方法相比，监测CTC 亚型对疾病状态具有较高的敏感性，它在监测预后和指导未来的个体化免疫治疗方面具有潜在的临床应用价值。

房玉霞等[18]将胃癌患者分为对照组(利用肿瘤标志物对胃癌进行诊断)和研究组(利用CTC 含量对胃癌患者进行诊断)，来比较两种方法对胃癌的诊断率。研究表明，研究组诊断的灵敏性和特异性均高于对照组，这就提示了通过CTC 检测胃癌发病具有较高的准确率，缩短检测时间，对胃癌的诊断具有重要意义。

3.2.3 循环肿瘤细胞(Circulating tumor cell,CTC)对胃癌检测的优势和局限性

循环肿瘤细胞的我们通常可以在血液中检测，是一种无创的检测方式，能够免除胃镜活检对患者造成的痛苦和伤害，有助于对胃癌肿瘤发展的实时监测，有助于于胃癌肿瘤转移患者的诊断、监测术后患者以及肿瘤的复发与转移、评估抗胃癌药物的敏感性与患者预后以及选择个体化治疗的策略[19]。在动物模型中，原位癌阶段就已经检测出了CTC 的存在，因此CTC 可能成为一个早期癌症诊断的有用工具[20]。

循环肿瘤细胞的检测和分析比较困难，在几百个白细胞中只存在单个数量的循环肿瘤细胞，目前的研究主要集中在寻找循环肿瘤细胞的特异性标志物并提高检测手段的敏感性和特异性[21]。

3.3 游离DNA (Cell-free DNA, cfDNA),和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)对胃癌诊断的分析

3.3.1 游离DNA (Cell-free DNA, cfDNA),和循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)概述

1977 年ctDNA 首次被发现，近些年由于分子生物学和基因测序的发展，使其得到了更为广泛的关注[22]。cfDNA 是细胞释放到血液中的DNA 片段，ctDNA 是肿瘤细胞释放到血液中的cfDNA。ctDNA 既可以是单链，也可以是双链，存在于血清和血浆中，cfDNA 的来源已知的有三种：①肿瘤细胞②循环肿瘤细胞③调网或坏死的肿瘤细胞[23]。在健康个体中，凋亡细胞和cfDNA 几乎完全清除，cfDNA 水平非常低，而在恶性肿瘤、慢性炎症和细胞过度死亡的情况下，cfDNA 将会大片堆积。通常，我们收集全血之后离心去除细胞，然后使用试剂盒将ctDNA 提取出来，在检测过程中最具有挑战性是确定cfDNA 在癌症中的特异性变异，目前先进的DNA 检测技术已经发展起来，变异的ctDNA 检测主要依靠PCR 和下一代测序(NGS)技术为主，NGS 提供了个性化癌症基因特征并有助于发展个性化医疗[24-25]。

3.3.2 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)在胃癌中的临床研究

Kim 等人[26]采用肿瘤特异性重排的方法监测胃癌患者术后血液中的ctDNA，采用全基因组测序(WGS)的方法分析25 例胃癌的个体化癌症特异性重组，并在术后12 个月进行ctDNA 监测，发现在19 个样本中出现ctDNA 的存在，在检测到ctDNA 阳性到胃癌复发的时间平均为4.05 个月，研究发现术后ctDNA 的存在与术后12 个月内胃癌的复发呈显著相关，提示术后ctDNA 监测对胃癌患者肿瘤复发的临床意义。

Normando Sávia Raquel Costa 等 人[27]做 了 一 项 分 析关于ctDNA 在进展期胃癌患者中的潜在作用。以每3 个月为时间单位，从每位患者身上获取样本(10 毫升总血液)，并同时进行CT 检查，直到疾病进展或死亡，测定总游离DNA(cfDNA)，根据ALU DNA 序列的表达率和总游离DNA 浓度计算ctDNA 水平，结果表明晚期胃癌患者的cfDNA 浓度明显高于正常对照组，在胃癌患者接受一个周期(3 个月)的化疗后，ctDNA 降低的患者其无病生存期(DFS)的时间远远高于高水平ctDNA 的患者，所得出的结论是ctDNA 可能是一种特异性、非侵入性和经济有效的新生物标志物。

Gao 等人[28]评估了30 例晚期胃癌患者的ctDNA 和原发肿瘤的突变谱，然后通过5 例患者的多次活检对肿瘤突变进行了综合分析，最后分析了70 例患者的ctDNA 和肿瘤配对组织中HER2 扩增的一致性。与单个肿瘤样本相比，ctDNA的突变谱一致性较低，在配对的组织样本中仅发现约50%的体细胞突变，但与多个活检相比，ctDNA 的大多数突变也出现在配对的肿瘤组织中。ctDNA 与肿瘤组织的HER2 扩增高度一致，可能是一种替代组织扩增的方法。提示基于ctdna 的评估可以部分克服肿瘤异质性，可能成为胃癌HER2 分析的潜在替代方法。

3.3.3 循环肿瘤DNA(circulating tumor DNA, ctDNA)对胃癌检测的优势和局限性

以往研究显示[29]，ctDNA 是胃癌早期诊断和检测治疗疗效的良好指标，早起的胃癌症状不明显，影像学检查难以发现病灶，胃镜是一个有创伤性的检查，不是应用于所有的人群，ctDNA 检验克服了两种检查的不足之处，对胃癌诊断提到一个辅助的作用，并且可以反映肿瘤组织中的基因突变，阐明异质基因的突变特变，提高癌症诊断的特异性。

ctDNA 的检测技术敏感性仍需要提高，这是当前检测的一个困难，并且检测ctDNA 的方法并没有达到标准化，检测的成本比较昂贵等问题[30]。

3.4 外泌体(exosome)对胃癌诊断的分析

3.4.1 外泌体(exosome)概述

1983 年，外泌体在绵羊网织红细胞中被首次发现[31]，他是一种小的(30-140nm) 膜结合颗粒，起源于大的多泡体(MVBs)通过融合释放到细胞外环境，在多种疾病中它们是一种很有前途的生物标志物[32]。在多种疾病中外泌体也可大量释放生物体液，如血浆、尿液、唾液、腹水和支气管肺泡灌洗液。许多细胞类型都可以释放外泌体释，如上皮细胞、造血细胞、神经元细胞、成纤维细胞、脂肪细胞等和肿瘤细胞[33]。循环的miRNA 在一些恶性疾病中的变化具有信息性，但miRNA 易降解，所以循环中的miRNA 会被打包成各种囊泡，外泌体就是其中的一种，其对肿瘤具有调控性。理想的外泌体分离可以分离出大量的纯化外泌体，对研究和检测有重要的意义，如外泌体中的蛋白质、DNA 和miRNA 的分析[34]。传统的外泌体分离方法是基于一系列的离心步骤排除细胞和细胞碎片，这种方法是目前最经济的方法，但比较耗时。Urbanelli 等人[35]总结了其他一些外泌体的分离方法.是利用超滤和层析的方法进行分离，然后用聚合物沉淀的方法进行纯化。每种方法都有优缺点。与CTCs 和cfDNA 相比，使用肿瘤外泌体作为预后、治疗指导的生物标志物主要依赖于它的蛋白质和miRNA 的表达谱。外泌体介导的生物活性长链非编码RNA 作为一种新型的非侵袭性的肿瘤诊断生物标志物，正受到越来越多的关注。

3.4.2 外泌体(exosome)在胃癌中的临床研究

Ohzawa Hideyuki 等人[36]提取了胃癌腹膜转移患者的腹膜液并进行了分离，分别从宏观和微观的角度进行了miRNA的表达分析。实验发现，12 胃癌腹膜转移的样本中有4 个miRNA(miR-21-5p、miR-92a-3p、miR-223-3p、miR-342-3p)显著上调，其表达水平与腹膜癌指数呈正相关。而miR-29 家族均下调。，在24 例胃癌腹膜转移患者，在胃切除术miR-29 表达量往往低于腹膜转移复发患者的miR-29b-3p表达量(P=.012)。实验表明，在腹膜液miRNA 的表达模式反映了腹腔肿瘤负荷，可能是一个有用的生物标志物的治疗点。

Cai 等人[37]对29 例健康人与63 例胃癌患者血清外泌体中Lnc RNA PCSK2-2:1 的表达进行了分析，利用受体工作特性曲线评价Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 作为胃癌辅助诊断标记物的临床价值。结果表示，与健康对照组相比，胃癌患者血清外泌体中Lnc RNA PCSK2-2:1 表达水平显著下调(P=0.006)。Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 的表达水平与肿瘤大小(P=0.0441)、肿瘤分期(P=0.0061)、静脉侵犯(P=0.0367)相关。Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 曲线下面积为0.896。其诊断的敏感性和特异性分别为84%和86.5%。数据表明，Exo-Lnc RNA PCSK2-2:1 可能在胃癌的发展中起着极其重要的作用，可以作为一个潜在的标记用于胃癌的诊断。

Soeda Naruyoshi 等人[38]探讨了外泌体包裹的miRNAs(ex-miRNAs)作为微创性生物标志物在接受治疗性手术的胃癌患者中的有效性。通过比较TNM II 期胃癌患者中腹膜复发(n=3)和术后未复发(n=3)的患者以及3 名健康志愿者的miRNA 芯片数据，选择了具有复发特异性的ex-miRNA，为外泌体包裹miRNA-21 (ex-miR-21)和外泌体miR-92a (exmiR-92a)。利用另外129 例II 期和III 期GC 患者的血浆外泌体样本，研究了ex-miR-21 和ex-miR-92a 作为生物标志物的潜在价值。实验结果表明，与健康对照组相比，GC 患者样本中的Ex-miR-21 水平显著升高，而ex-miR-92a 水平显著降低。高miR-21 水平的II 期和III 期患者的总生存(OS)和腹膜无复发生存(PRFS)较低miR-21 水平的患者更差。低ex- 92a 水平的II 期和III 期患者的OS 和PRFS 明显差于高ex- 92a 水平的患者。Cox 多因素分析显示，ex-miR-21和ex-miR-92a 是II 期和III 期胃癌OS 和PRFS 的独立预后因素。miR-21 和程序性细胞死亡蛋白4 mRNA 表达水平与miR-92a 和前列腺素E 受体4 mRNA 表达水平呈负相关。因此，ex-miR-21 和ex-miR-92a 可能作为预测II/III 期胃癌患者腹膜复发和预后的有效的微创性生物标志物。

3.4.3 外泌体(exosome)对胃癌检测的优势及局限性

外泌体通过协助筛选特异性基因来对胃癌患者起到一个早期诊断，早期治疗以及疾病进程的检测有很重要的意义，其结构因为有囊泡的存在，所以能够使遗传物质稳定的存在其研究前景十分可观。对于发现肿瘤治疗的新靶点，可能具有重要的意义，有待于进一步的研究[39]。

当今的技术对于外泌体的分离和提取仍需要进一步的标准化，这也是外泌体研究的瓶颈所在。

3.5 肿瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)对胃癌诊断的分析

3.5.1 肿瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)概述

2015 年，TEPs 由Best 新提出的一个概念[40]。血小板中含有丰富的RNA，在癌症的发生发展过程中，肿瘤细胞可以通过不同的途径影响血小板，从而影响到血小板中的RNA 和蛋白质，使其形成肿瘤相关血小板，肿瘤细胞能够使血小板中的RNA 发生特异性的剪接，从而形成的独特的miRNA 表达谱，有利于胃癌的诊断，在未来有可能会成为胃癌的检测标志物[41]。提取方式首先要从全血中利用差速离心分离血小板，提取RNA，然后进行RNA 的扩增和测序。

3.5.2 肿瘤血小板(tumor educated platelets, TEPs)对胃癌检测的优势和局限性

TEPs 较替他液体活检相比，血小板的数量多，利于提取，在未来胃癌的诊治以及治疗检测中可能起着重要的作用[41]。TEPs 是近几年新兴的一种研究方向，灵床关于此类的报道较少，在临床的应用也甚少，其技术有待发展。

4 小结

液体活检在精准医疗领域中扮演着十分重要的角色，因为它代表了一种无创性的癌症治疗策略，可以根据个人的特点实现个性化的诊断和治疗。与常规影像学检查及实体活检相比，液体活检更敏感和准确，并提供了大量更多关于预后和治疗方向的信息。这篇综述了四种液体活检方法的优缺点以及最新临床研究进展，其主要的问题是缺乏标准和方便的技术，这也是当今液体活检用于胃癌发展领域的一项挑战。最后，虽然很多研究已被实施液体活检具有临床效用，但大多数是回顾性的研究，因此，需要更严格的研究来验证液体活检的巨大潜力。