NPY基因多态性对番鸭产蛋性能的影响

周 璇，谭 斌，杨世皓，罗林丽，祝永才，王 姣，杨胜林

(1.贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 动物科学学院，贵州 贵阳 550025)

番鸭是优良的肉用鸭，具有生长快、耐粗饲和抗病力强等特点，在现代养禽业中具有特殊的价值和地位，拥有很高的市场需求量[1]。育成时间较长(24～26周)、年产蛋数较少(100～130枚)且就巢性较强等因素，导致番鸭的繁殖性能较低，饲养成本增加。此外，就巢会使卵巢退化导致停产，增加窝外蛋和破损蛋的数量，降低番鸭的利用价值[2]。神经肽Y(Neuropeptide Y，NPY)也称神经肽酪氨酸，是生物体内高度保守的重要神经递质，广泛表达于动物机体，在中枢神经系统尤为丰富。NPY主要通过与G蛋白偶联受体相互结合，直接或间接发挥相应的生理调节作用。目前，哺乳动物中鉴定出来的NPY受体有Y1、Y2、Y4、Y5及Y6等5种[3-5]。NPY调节着动物的摄食行为[6]、能量代谢[7]、激素分泌与释放[8]、生物节律[9]、心血管[10]等多种生理活动，影响着成骨细胞活性，调节骨量与体质量平衡，影响不同阶段的骨形成及骨吸收，调控骨折愈合等[11-14]。此外，NPY基因也影响着动物的繁殖性能[15]。神经肽Y-Y1受体基因(NPY-Y1R)的F等位基因与山羊性早熟和高繁殖力相关[16]，NPY基因GA/AT突变位点的W等位基因与提高绵羊产羔数有关[17]，NPY基因的多态性还影响着文昌鸡和邵伯鸡的开产体质量[18-19]。以上研究表明，NPY可以作为繁殖性能相关的分子遗传标记。当前，国内外对NPY基因在水禽繁殖性能方面研究相对较少，对番鸭进行繁殖性状转录组测序分析后发现，NPY基因与番鸭繁殖性能相关[20]。鉴于此，为探讨NPY基因多态性与番鸭繁殖性状的关联性，以天柱黑番鸭为研究对象，采用PCR产物纯化直接测序法对NPY基因进行单核苷酸多态性(SNP)位点进行筛查，分析其与产蛋性能的相关性，旨在为寻找天柱番鸭繁殖性状相关的分子标记提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验动物和产蛋性能指标

从贵州天柱县骡鸭科技繁殖场选取90只天柱母番鸭，记录每只的开产日期、开产蛋质量以及300日龄产蛋量，每只鸭均采取4～5 mL血样，存于EDTA抗凝管中，置-20 ℃备用。

1.2 试验试剂与仪器

DNeasy Blood & Tissue Kit(250)试剂盒、2×TaqPCR Master Mix、琼脂糖均购自天根生化(北京)科技有限公司，DL2000 DNA Marker购自诺唯赞生物科技(南京)有限公司。

多任务梯度PCR扩增仪(美国Bio-Rad公司)、凝胶电泳仪(北京市六一仪器厂)、超微量紫外分光光度计(美国Thermo Scientific公司)。

1.3 引物设计及PCR扩增

根据GenBank收录的绿头鸭NPY基因序列(登录号：NW_004677092)，利用Primer Premier 5.0及NCBI对NPY基因进行扩增引物设计，并送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。运用DNAStar软件的SeqMan、EditSeq程序对NPY基因外显子和5′端启动子区多态位点测序结果进行筛查，在其3个外显子均未发现多态位点，5′UTR发现2个多态位点，引物序列与预扩增产物信息见表1。PCR扩增体系(30 μL):2×TaqPCR Master Mix 13 μL，上下游引物各2 μL，番鸭模板DNA 2 μL，ddH2O 11 μL；扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s,55.7 ℃退火30 s,72 ℃延伸35 s,35个循环；72 ℃终延伸5 min,4 ℃反应终止。扩增引物采用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测后，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

表1 引物序列信息

1.4 生物信息学分析

采用生物信息学软件预测NPY基因核心启动子区、CpG岛范围、转录因子结合位点等启动子区的调控元件，比较其在NPY基因突变前后的变化[21](表2)。

表2 生物信息学在线软件

1.5 数据分析

运用DNAStar软件SeqMan、EditSeq程序筛查NPY基因启动子区多态位点测序结果，运用SHEsis在线软件(http://analysis.bio-x.cn/myAnalysis.php)计算其基因型频率、等位基因频率、遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)、多态信息含量(PIC)以及Hard-Weiberg平衡(χ2)等。采用SPSS 18.0软件进行单因素方差分析(One-way ANOVA,LSD)，对基因型与产蛋性能的关联性进行显著性分析[22-24]。

2 结果与分析

2.1 NPY基因SNP位点鉴定

利用DNAStar软件SeqMan、EditSeq程序比对分析序列，并结合测序峰图鉴定SNP位点，在番鸭5′UTR的启动子区发现2个SNP位点A411G和A540G，这2个位点均产生3种基因型AA、AG和GG(图1)。

图1 NPY基因SNP位点鉴定

2.2 NPY基因SNP位点遗传特性

对番鸭NPY基因2个SNP位点进行基因型频率、等位基因频率、有效等位基因数、多态信息含量等遗传特性的分析(表3)。由表3可知，番鸭NPY基因A411G位点的优势基因型是频率为0.467的AG基因型，优势等位基因是频率为0.611的G等位基因；A540G位点的优势基因型是频率为0.467的AG基因型，优势等位基因是频率为0.533的A等位基因；2个SNP位点均处于中度多态(0.250.05)。

表3 SNP位点在番鸭中的群体遗传信息

2.3 NPY基因SNP位点的连锁不平衡、单倍型及双倍型分析

对番鸭NPY基因2个SNP点A411G、A540G进行连锁不平衡分析，结果表明，2个SNP位点D′值等于1，r2值大于0.33，2个SNP位点间具有强连锁不平衡效应。番鸭NPY基因2个突变位点的单倍型和双倍型分析表明，番鸭NPY基因中A411G、A540G位点存在3种单倍型H1、H2和H3，频率分别为0.467、0.389和0.144。共检测到4种双倍型，双倍型H1H2(AGAG)最高，频率为0.467，其次是H1H1(GGGG)，频率为0.233，双倍型H2H2(AAAA)和H3H3(GGAA)频率相对较低，分别为0.156和0.144(表4)。

表4 NPY基因2个SNP位点的单倍型和双倍型分析

2.4 NPY基因核心启动子范围预测

通过2种不同软件对番鸭NPY基因的核心启动子区进行预测，结果显示，2个软件均预测到1个核心启动子区，表明NPY基因具有明显的启动子识别特征。2个软件预测核心启动子区域均在-2 400 bp左右，表明NPY基因核心启动子区域可能在-3 031～-2 400 bp处，推测其突变可能引起NPY基因的表达(表5)。

表5 NPY基因核心启动子区预测

2.5 NPY基因CpG岛预测

选用3种不同的软件分析预测NPY基因CpG岛，将参数设置为Obs/Exp 值大于0.6，GC含量大于50%，范围大于200 bp。预测结果显示，未发现CpG岛的存在。

2.6 NPY基因转录因子结合位点预测

通过3种不同软件预测番鸭NPY基因的转录因子结合位点，发现NPY基因转录因子结合位点在其序列突变前后均没有发生变化(表6)。

表6 NPY基因转录结合位点预测

2.7 NPY基因SNP位点与番鸭产蛋性能的关联性分析

对番鸭NPY基因2个突变位点A411G和A540G进行产蛋性能的关联性分析，结果表明，在番鸭开产日龄上，基因型AG极显著(P<0.01)早于基因型AA；在开产蛋质量上，基因型GG显著(P<0.05)高于基因型AA；在300日龄产蛋量上，基因型GG极显著(P<0.01)高于基因型AA，基因型AG显著(P<0.05)高于基因型AA(表7)。双倍型H1H1的开产日龄显著(P<0.05)早于其余双倍型；双倍型H3H3的开产蛋质量显著(P<0.05)高于H1H1和H1H2，其300日龄产蛋量显著(P<0.05)高于H1H2和H2H2(表8)。

表7 番鸭NPY基因SNP位点与蛋壳品质的关联性分析

表8 NPY基因2个SNP位点双倍型对番鸭产蛋性能关联性分析

3 结论与讨论

启动子对基因表达的调控主要通过控制基因的表达水平、表达部位以及表达方式等，当其基因组水平上的单个核苷酸发生变异时会导致启动子的多态性[25]。本研究在NPY基因5′启动子区发现了2个多态位点，使用2种不同软件对NPY基因核心启动子区进行预测，软件均在-2 400 bp附近预测出1个核心启动子区，表明-3 031～-2 400 bp区域可能是NPY基因的核心启动子区域，说明NPY基因具有明显的启动子识别特征。转录因子结合位点是通过与转录因子结合相互作用来调控基因的转录过程，其改变会影响基因的表达[26]。本研究采用3种生物学软件对NPY基因转录因子结合位点进行预测发现，突变前后NPY基因转录因子结合位点均未发生改变，但这也可能会导致启动子区域构象改变，对机体的生产性能以及疾病发生等方面有影响。

神经肽Y是胰多肽家族的一员，参与消化、循环系统和神经内分泌系统的调节以及抗焦虑作用等机体的多种生物学效应[27]。本研究对天柱番鸭NPY基因多态性与繁殖性状相关性进行研究，发现NPY基因多态性与番鸭的开产日龄相关，基因型AG极显著早于基因型AA，这与皋黄鸡上的基因型GG显著早于基因型AG不同[28]；本研究发现，NPY基因多态位点与番鸭的开产蛋质量有关联性，基因型AG显著高于基因型AA，与武定鸡上基因型AB极显著高于基因型AA、BB结果一致[18]。此外，本研究认为，NPY基因多态性与番鸭的产蛋量相关联，基因型GG极显著高于基因型AA，基因型AG显著高于基因型AA，这与武定鸡上基因型BB极显著高于基因型AA、AB[18]，与皋黄鸡上基因型GG显著高于基因型AG、AA相似[28]，但与文昌鸡上基因型AA显著高于其他基因型[29]、东兰乌鸡上基因型AA显著高于基因型BB[30]、矮小型青脚麻鸡上基因型AA、BB显著高于基因型AB[31]等不同。

本研究中2个多态位点产生3种单倍型和4种双倍型(理论上是4种单倍型和10种双倍型)，可能是由于样本量不足等因素导致。本研究通过对NPY基因SNP位点与番鸭繁殖性状的关联性分析表明，2个SNP位点产生的基因型在开产日龄上表现出来的差异总体不大，基因型AG极显著早于基因型AA，双倍型H1H1显著早于其他双倍型；2个SNP位点所对应的基因型在开产蛋质量上完全相同，而基因型AG显著高于基因型AA，双倍型H3H3显著高于其他双倍型；此外，2个SNP位点所对应的基因型在300日龄产蛋量上基本相似，但基因型GG极显著高于基因型AA，基因型AG显著高于基因型AA，双倍型H3H3显著高于其他双倍型。综上，本研究发现的2个SNP位点变异所产生遗传效应基本相似，基因型AG和双倍型H3H3可能是影响番鸭产蛋性能的有利基因型和双倍型。但由于样本较少，有待进一步试验加以验证。