健胃止疼五味胶囊质量标准提升

李丹，许妍，姜军华

江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，南昌 330029

健胃止疼五味胶囊的质量标准现行标准为国家食品药品监督管理总局国家药品标准ZZ-9378-1［1］，由干姜、诃子、紫硵砂、光明盐、荜茇五味药组成，具有祛寒健胃，止疼的功效。用于胃肠痉挛，脘腹冷疼，食欲不振，寒性呕吐，腹泻。现行标准项下有化学鉴别，两个薄层色谱分别以胡椒碱为对照鉴别荜茇、以没食子酸为对照鉴别诃子，两个含量测定分别以胡椒碱为对照品测定荜茇含量和以没食子酸为对照品测定的诃子含量，但现行标准存在以下问题：一是荜茇的薄层鉴别中，原方法提取效率低，再加上含有有毒性试剂苯；二是诃子的薄层鉴别中仅以没食子酸为对照品，不能全面反映诃子的内在质量；三是诃子含量测定中，仅能测到游离的没食子酸。本研究不仅针对上述问题进行修订，还增加了君药干姜的薄层鉴别，旨为提升健胃止疼五味胶囊的质量标准提供参考。

1 实验材料

仪器与试剂：LC-20AD 高效液相色谱仪（岛津液相工作站，PDA 检测器）；TLC Visualizer 薄层成像系统（瑞士Camag 公司）；色谱柱：Waters Sunfire C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），Waters Symmetry C18 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），GRACE Alltima C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；BT25S 型十万分之一电子天平（赛多利斯）；ML204T 型万分之一电子天平（梅特勒特里多）。没食子酸对照品（批号：110831-201204，含量89.9%），干姜对照药材（批号：120942-200907），胡椒碱对照品（批号：110775-201405），均购于中国食品药品检定研究院。健胃止疼五味胶囊三批（乌兰浩特中蒙制药有限公司，批号分别为：150902，160421，160433）；阴性样品：取缺诃子的其余各药材，按处方量及工艺自制；取缺干姜的原辅料，按处方量及工艺自制；阴性取缺荜茇的原辅料，按处方量及工艺自制。硅胶G 薄层板（10 cm×20 cm,青岛海洋化工有限公司）。试剂：Milli-Q 超纯水，甲醇、乙腈均为色谱级，其他均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 干姜的薄层鉴别 取本品胶囊内容物1 g，加乙酸乙酯20 mL，回流提取30 min，滤过，蒸干，残渣加甲醇2 mL 复溶，作为样品溶液。取干姜对照药材0.15 g，加70%乙醇20 mL，加热回流30 min，滤过，蒸干，加水10 mL，用乙酸乙酯20 mL 振摇提取，分取上层，蒸干，残渣加甲醇1 mL 复溶，作为干姜对照药材溶液。取阴性样品，同法制成缺干姜阴性对照溶液。照中国药典2015 年版四部通则0502 薄层色谱法试验，吸取样品溶液、对照药材溶液、阴性溶液各10 μL，分别点于10 cm×20 cm 的硅胶G 薄层预制板上，以石油醚（60 ℃～90 ℃）-乙酸乙酯-甲醇-冰醋酸（20∶3∶1∶0.4 ）为展开剂进行展开，展开两次，在365 nm紫外光灯下进行检视。结果显示，阴性样品无干扰，三批样品与干姜对照药材色谱行为一致，且斑点清晰见图1a。

2.1.2 荜茇的薄层鉴别 取本品胶囊内容物1 g，加无水乙醇10 mL，超声30 min，取上清夜作为样品溶液。另取胡椒碱对照品2 mg，置2 mL 棕色容量瓶中，加无水乙醇使溶解并定容至刻度，作为对照品溶液。取阴性样品，同法制成缺荜茇阴性对照溶液。照中国药典2015 年版四部通则 0502 薄层色谱法试验，吸取样品溶液、对照品溶液、阴性溶液各2 μL，分别点于10 cm×20 cm 的硅胶G 薄层预制板上，以环己烷-乙酸乙酯-无水乙醇（8∶2∶1）为展开剂进行展开，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，在日光下进行检视。结果显示缺荜茇阴性对照无干扰，三批样品色谱在与胡椒碱对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点，见图1b。

2.1.3 诃子的薄层鉴别 取本品胶囊内容物1 g，加无水乙醇10 mL，超声30 min，取上清夜作为样品溶液。取诃子对照药材0.5 g，同法制成对照药材溶液。取阴性样品，同法制成缺诃子阴性对照药材溶液。吸取样品溶液、对照药材溶液、阴性溶液各10 μL，分别点于同一硅胶GF254 薄层预制板上，以环己烷-醋酸乙酯-甲酸（12∶8∶1）为展开剂，进行展开，在254 nm 紫外光灯下检视。结果表明阴性样品无干扰，三批样品与诃子对照药材色谱行为一致，且斑点清晰，见图1c。

2.2 诃子的含量测定

2.2.1 色谱条件 色谱柱：Waters Sunfire C18 柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；洗脱梯度：0.1%磷酸溶液-甲醇（95∶5）；流速：1.00 mL/min；柱温：30 ℃；检测波长：273 nm。

2.2.2 供试品溶液的制备 取样品10 粒，精密称定内容物，混匀，研细，取约0.1 g，精密称定，置150 mL 具塞锥形瓶中，精密加入4 mol/L 盐酸溶液25 mL，水浴中加热水解2 h，冷却至室温，转移至50 mL 容量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品12.80 mg（含量为89.9%），置50 mL 棕色量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，制成的没食子酸对照储备液；再精密移取3 mL 上述储备液至50 mL棕色量瓶中，加50%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，作为没食子酸对照品溶液。

2.2.4 线性关系的考察 精密吸取“2.2.3”中没食子酸对照品溶液1、5、10、15、20、25μL，液相色谱仪进样分析，按“2.2.1”项下色谱条件测定没食子酸的峰面积，以进样量（C）为横坐标，以峰面积（A）为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程 为Y=3 231 713.844 1X-1 393.342 8，r=1.000 0。表明没食子酸在0.013 8～0.345 2 μg 之间呈良好的线性。

2.2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.3”中没食子酸对照品溶液10 μL，连续进样6 次，结果没食子酸峰面积分别为448 956、449 374、449 025、448 937、450 803、447 194，其RSD 为0.3%，表明精密度良好。

2.2.6 重复性试验 平行称取样品（批号为160433）6 份，照“2.2.1”项下方法，依法测定，其结果分别为6.572 7、6.386 3、6.413 2、6.581 5、6.382 1、6.386 4 mg/g，RSD 为1.5%，表明重复性好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取样品溶液（批号160433）10 μL，每隔一定时间进样一次，结果供试品溶液中没食子酸在12 h 内峰面积无明显变化，其RSD为1.5%，结果表明样品溶液12 h内是稳定的。

2.2.8 准确度试验 采用样品加标回收试验，取样品（批号160433），适量，研匀，取约0.05 g，精密称定，平行称取6 份，分别置150 mL 锥形瓶中，精密加入含适量没食子酸对照品的4 mol/L 盐酸溶液25 mL，水浴中加热水解2 h，放冷，转移至50 mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，滤过，取续滤液，照“2.2.1”项下方法试验，计算回收率，结果回收率良好，适合本品的含量测定。结果见表1。

表1 回收率试验结果

2.2.9 耐用性试验 精密吸取“2.2.3”项下同一样品溶液，照“2.2.1”项下方法进样分析，再分别用三种不同型号的C18 柱（Waters Sunfire C18 柱、Waters Symmetry C18 柱、GRACE Alltima C18 柱）进行测定，结果没食子酸峰在各种色谱柱均分离良好，测得含量无显著差异，见表2。

表2 色谱柱考察测定结果

2.2.10 样品测定 取本品3 批，照“2.2.1”项下方法进行测定，测定结果见表13。此外再将此结果与原标准国家食品药品监督管理总局国家药品标准ZZ-9378-1 含量测定项下诃子的结果进行比较，结果修订后方法所测没食子酸为总没食子酸的量，比原方法所测的量有10%左右的增加，见表3。

表3 标准修订前后没食子酸的结果比较

3 讨论

3.1 薄层色谱

本研究对荜茇、诃子的薄层色谱方法进行修订，同时增加了干姜的薄层色谱方法。将荜茇的提取式由冷浸改成了超声，提高了提取效率，考虑到苯已经被《中国药典》2020 年版［2］禁用，故重新考察了展开条件，最终确定为环己烷-乙酸乙酯-无水乙醇（8∶2∶1）；为全面反映诃子的内在质量，将诃子的TLC 色谱中没食子酸换成诃子对照药材；干姜属君药，含有挥发油，二苯基庚烷，姜辣素等多种化学成分［4-6］，干姜味辛性热，有温中散寒、回阳通脉、温肺化饮的功效［7,8］，故增加干姜的薄层鉴别，更好地控制产品质量。

三个薄层色谱条件均考察了不同温度（8.0 ℃，25 ℃，35 ℃）、湿度（32%，50%，72%）、不同厂家和型号的薄层板（自制的硅胶G 板与GF254板，上海东方G 板与GF254 板，青岛海洋G 板与GF254 薄层板），结果显示不同温度、湿度，不同薄层板对分离效果无影响。

3.2 诃子的含量测定

关于没食子酸的含量有较多报道［9-11］，本文中通过对没食子酸在200～400 nm 波长范围内进行光谱扫描，结果在217 nm 波长处有最大吸收，但为末端吸收，样品中峰杂质大，参照《中国药典》2015 年版一部［3］五倍子的没食子酸含量测定项，故确定273 nm 为测定波长。参考中国药典2015 年版一部“五倍子”标准，采用4 mol/L 盐酸水解测总没食子酸的方法。此外，还考察了提取溶剂体积（10、25、50 mL）、提取时间（1、2、4 h），结果表明提取溶剂体积为25 mL 和50 mL 时相差不大，提取时间 2 h 基本水解完全。最终确定了测定条件采用4 mol/L 盐酸作为提取溶剂，提取体积为25 mL、提取时间为2 h，检测波长为273 nm。