凝胶排阻层析纯化破伤风抗毒素条件优化的研究

周年，王安华，洪燕，郑洋滨，刘宁

1.江西省药品检验检测研究院，国家药品监督管理局中成药质量评价重点实验室，江西省药品与医疗器械质量工程技术研究中心，南昌 330029；2.南昌轨道交通集团有限公司，南昌 330038

破伤风抗毒素是经典的一种马抗血清制品，它能中和血液中破伤风梭菌产生的破伤风毒素，缓解破伤风症状和降低病死率。人类应用破伤风抗毒素防治破伤风历史已近百年，挽救了许多人的生命，但其临床应用存在一定的局限性［1］。传统工艺生产的破伤风抗毒素有效成分F（ab'）2纯度较低，残存的大分子马免疫球蛋白（IgG）及小分子杂蛋白引起的不良反应发生率高，制约了破伤风抗毒素的临床应用和进一步发展。因此本研究根据破伤风抗毒素成品中F（ab'）2、IgG 及小分子杂蛋白分子量的不同，拟应用凝胶排阻层析，以紫外检测蛋白质特征峰A280nm 绘制的散点图为评价指标，考察不同流速、洗脱剂、样品浓度对破伤风抗毒素蛋白分离的影响，经非还原型十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳后对不同组分染色结果进行扫描对比；按照《中国药典》2015 版异常毒性检查法对纯化后的组分进行安全性检查。

1 材料与方法

1.1 材料

破伤风抗毒素（0.75 mL，1 500 IU/支），购自江西生物制品研究所，批号：20 180106；葡聚糖凝胶G-100（Sephadex G-100）（批号：10244707，瑞典GE healthcare Bio-Science）；磷酸二氢钾（批号：20180703，国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（批号：20160518，广东光华科技股份有限公司）；蛋白分子量标准品（10-180 KDa）：（伊莱萨，批号：EL2661）；常规考马斯亮蓝染色液，批号：1210A19，Tris-HCl 缓冲液（0.5 mol/L，pH6.8），丙烯酰胺-亚甲基双丙烯酰胺溶液（30%，29∶1），批号：1210A19，均购自北京雷根生物技术有限公司；其他化学试剂均为分析纯或化学纯。

1.2 实验动物

健康豚鼠4 只，雄性，体重250～350 g，动物合格证号：No.1107262011 001398；健康KM 小鼠10 只，雌雄各半，体重18～22 g，动物合格证号：No.430726201100264323，均购自长沙市天勤生物技术有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）：2019-0014。小鼠、豚鼠分别饲养于本院屏障环境和普通环境中，实验动物使用许可证号：SYXK（赣）：2019-0001。

1.3 仪器与设备

SBS-100 数控计滴自动部分收集器（上海沪西分析仪器厂有限公司）；FreeZone®2.5 升冷冻干燥机（美国labconco 公司）；UV-2600 紫外分光光度计（日本岛津）；Bio-Rad 电泳仪（美国伯乐公司）；Milli-Q Reference 超纯水仪（密理博）；UW2200H动物天平（日本岛津）。

1.4 Sephadex G-100 正式装柱处理流程

1.4.1 预处理 用超纯水煮沸至少1 h 直至充分溶胀，凝胶体积不再变化，期间不断搅拌以保证凝胶溶胀。在溶胀前，自然沉降后若上层溶液中漂浮的凝胶碎片颗粒较多，需要重复多次漂洗将其除去，防止层析时阻塞凝胶柱影响流速。

1.4.2 装柱 将溶胀好的凝胶根据装柱要求一次性置入玻璃柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层，装柱要均匀。

1.5 破伤风抗毒素凝胶排阻层析分离、纯化条件的研究

经过预处理的Sephadex G-100 进行装柱，凝胶柱规格：150 cm×2.5 cm，先用洗脱液平衡直到流出液的pH 值等于上柱洗脱液的pH 值后，上样、洗脱。检测波长：280 nm，采用数控计滴自动部分收集器每间隔一段时间收集一管洗脱组分。每个组分管重复收集5 次，合并相同次数的组分，冷冻干燥，进行异常毒性检查。

1.5.1 不同洗脱液流速 根据凝胶柱规格，按照分级分离原则将上样体积约定为柱床体积的1%即为5 mL。以磷酸盐缓冲液（pH6.5）作为洗脱液，样品浓度为原液（100%），分别控制流速为0.6 mL/min、0.3 mL/min，研究不同流速对破伤风抗毒素蛋白分离效果影响。

1.5.2 不同洗脱液 固定上样体积为5 mL，样品浓度为100%，洗脱液流速0.3 mL/min，分别以超纯水、磷酸盐缓冲液（pH6.5）作为洗脱液，研究不同洗脱液对破伤风抗毒素蛋白分离效果影响。

1.5.3 不同样品浓度 以磷酸盐缓冲液（pH6.5）作为洗脱液，固定上样体积为5 mL，流速为0.3 mL/min，样品浓度分别为80%、100%，研究上样浓度对破伤风抗毒素蛋白分离效果影响。

1.6 经Sephadex G-100 纯化前后F（ab'）2 电泳染色图对比

根据紫外检测蛋白质特征峰A280nm绘制的散点图，取经Sephadex G-100 纯化后处于散点图峰值附近的四管组分管（分别标记为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），加4×上样缓冲液混匀后100 ℃水浴5 min，经非还原型SDS-PAGE 凝胶电泳（上样量：8 μL；以恒压60 V 条件开始电泳至跑至分离胶调至100 V）后，参照考马斯亮蓝染色液说明书将电泳后的凝胶染色，脱水至条带清晰后拍照保存，并将图像背景调至白色，蛋白条带为灰色。

1.7 经Sephadex G-100 纯化后Ⅲ组分异常毒性的检查

选取上述1.6 的Ⅲ组分管，重复收集5 次，合并相同的组分，冷冻干燥，按照《中国药典》2015版异常毒性检查法进行异常毒性检查。

2 结果

2.1 不同洗脱液流速对Sephadex G-100 分离蛋白效果的影响

由图1 可以发现，A 流速（0.3 mL/min）的分离效果优于B 流速（0.6 mL/min），因此，本实验选择洗脱流速为0.3 mL/min。

2.2 不同洗脱液对Sephadex G-100 分离蛋白效果的影响

由图2 可知，不同的洗脱液对Sephadex G-100分离蛋白效果基本无影响，对上样的样品进行pH检测结果为6.5。为更好地考虑整个分离过程中样品的稳定性，我们选择跟样品相同pH 的磷酸盐缓冲液作为洗脱液。

2.3 不同样品浓度对Sephadex G-100 分离蛋白效果的影响

从图3 可看出，当上样浓度为100% 时，分离效果更好，同时凝胶排阻层析分离会使样品稀释，因此，在不影响分离效果的前提下，应尽可能提高上样浓度。即本实验选择样品浓度为100%。

2.4 破伤风抗毒素有效成分F（ab'）2 经Sephadex G-100 纯化前后电泳染色图对比

综合2.1～2.3 的实验结果，凝胶排阻层析分离破伤风抗毒素蛋白的优化条件为以磷酸盐缓冲液（pH6.5）为洗脱液，样品浓度为100%，流速为0.3 mL/min。选取处于散点图两个峰值附近的四管组分管（Ⅰ、Ⅱ为第一个峰值附近的两管，Ⅲ、Ⅳ为第二个峰值附近的两管）。从图4 可知，整个纯化过程中，I 组分为少量大分子IgG 与有效成分F（ab'）2先洗脱下来，Ⅱ组分为IgG、F（ab'）2与少量的小分子杂蛋白共同洗脱下来，Ⅲ组分主要为F（ab'）2洗脱下来，最后Ⅳ组分为F（ab'）2、小分子杂蛋白共同洗脱下来。其中Ⅲ组分F（ab'）2的纯度最高。

2.5 经Sephadex G-100 纯化后Ⅲ组分异常毒性的检查

取纯化后重复五次收集的Ⅲ组分，经冷冻干燥后，加入无菌生理盐水溶解，分别采用小鼠及豚鼠腹腔注射溶液的方式（小鼠注射剂量为0.5 mL；豚鼠注射剂量为5 mL），观察注射后反应情况和7 d内的死亡情况。结果小鼠及豚鼠观察期内均健存，且无眼球突出、呼吸急促、行动失调、昏倒、麻痹、匍匐、痉挛、惊厥等反应，7 d 后小鼠及豚鼠的体重均增加，表示Ⅲ组分无异常毒性。

3 讨论

当前破伤风抗毒素的生产工艺主要为破伤风类毒素免疫马匹后采集的血浆经胃蛋白酶消化，后者在IgG 铰链区二硫键的近羧基端处将其剪切为F（ab'）2片段和若干无生物活性的小分子多肽pFc'片段，然后去除大量白蛋白、可溶性杂质及Fc 片段，最后超滤除盐、浓缩和去小分子蛋白。主要表现为有效成分F（ab'）2、大分子IgG 和小分子杂蛋白同时存在。大分子IgG 容易导致过敏性休克和血清病两类过敏反应；小分子杂蛋白则是引起皮肤过敏试验假阳性反应的主要物质，所以破伤风抗毒素在临床使用前必须进行皮肤过敏试验，简称皮试。据文献资料报道，破伤风抗毒素的皮试阳性率达到52.5%，并且无论采用皮试阴性直接注射还是皮试阳性脱敏注射的方法，注射破伤风抗毒素均有较多的过敏反应产生［2-4］，因此在一些欧美发达国家早已禁止使用马源破伤风抗毒素，而选择20 世纪60 年代研制出的人破伤风免疫球蛋白代替，但由于存在市场血源供应严重不足、价格昂贵、产量极其不稳定、同源污染等缺点，因而在我国临床上广泛应用于破伤风被动免疫和破伤风治疗的仍为破伤风抗毒素［5］。

《中国药典》2015 版破伤风抗毒素检验项下F（ab'）2含量标准规定预防用及治疗用从2010 版的应不低于50%及60%提升到了应不低于60%及70%，同时IgG 含量也从应不高于10%降低为应不高于5%［6,7］。可见针对破伤风抗毒素生产工艺的发展现状及其临床使用的局限性，我国现行国家标准提高了对此类生物制品纯化工艺的要求，建议增加柱色谱、免疫吸附等纯化技术和完善酶解工艺［8,9］。本研究根据破伤风抗毒素成品中F（ab'）2、IgG 及小分子杂蛋白分子量的不同，使用Sephadex G-100装柱，以紫外检测蛋白质特征峰A280nm绘制的散点图为评价指标，采用单因素试验考察不同流速、洗脱液、样品浓度对破伤风抗毒素蛋白分离的影响。确定了凝胶排阻层析纯化破伤风抗毒素蛋白的最佳条件为以磷酸盐缓冲液（pH6.5）为洗脱液，样品浓度为100%，流速为0.3 mL/min；经非还原型SDS-PAGE 凝胶电泳结果表明在该条件下可以较好地纯化破伤风抗毒素有效成分F（ab'）2，其中Ⅲ组分F（ab'）2的纯度最高；异常毒性检查小鼠及豚鼠均正常存活，表明Ⅲ组分无异常毒性。说明优化的凝胶排阻层析条件可以较好地纯化破伤风抗毒素有效成分，且安全无毒，为进一步推动该类生物制品的质量提高提供参考。