清热除湿凝胶对HPV 16 阳性的宫颈癌荷瘤小鼠线粒体凋亡蛋白的影响

刘 君 马秀丽 薛晓鸥

1.北京中医药大学东直门医院妇科，北京 100700；2.首都医科大学附属北京中医医院妇科，北京 100700

宫颈癌是目前全球范围内威胁女性生命健康的第四大恶性肿瘤[1]。有研究显示，我国每年新发宫颈癌患者近10 万，约有3 万例患者因该病死亡[2]，发病年龄也逐步趋于年轻化。已经证实，高危型人乳头瘤病毒（HPV）感染是导致宫颈发生癌变的首要因素[3]。所以防治HPV 感染成为预防宫颈癌的重中之重，课题组的前期研究证实清热除湿凝胶有较好的HPV 转阴率，对HPV16 阳性的SiHa 细胞移植瘤的增殖有较好的抑制作用。本研究进一步观察药物对实验鼠肿瘤组织线粒体凋亡蛋白表达的影响，以求能探究药物发挥抑瘤作用的部分机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

50 只4～5 周龄雌性BALB/c 裸小鼠，体重（15±1）g，SPF 级，购自北京维通利华实验动物技术有限责任公司（SCXK 京2016-0006），饲养于北京中医药大学动物实验中心（温度：23～25℃，湿度：49%～51%）。实验经北京中医药大学医学与实验动物伦理委员会批准，批准编号：BUCM-4-2019041002-2041。

1.2 细胞

HPV16 阳性人宫颈癌SiHa 细胞株，购自中国医学科学院基础医学研究所细胞中心。

1.3 药物、主要试剂与仪器

清热除湿凝胶及凝胶中辅料卡波姆940 由百川飞虹技术有限公司生产提供。顺铂注射液（齐鲁制药有限公司，生产批号：8M0506B02），10 mg/支。上海翊圣生物科技的TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（瑞士罗氏生物公司，货号：11684817910）；重组Anti-Bax，ab2503、Anti-Bcl-2，ab182858、Anti-Caspase-9，ab202068、Anti-Caspase-3，ab184787（美国Abcam 公司）；PVDF转印膜（美国PALL，货号：XLL092-2）；ECL 化学发光试剂（美国PIERCE，货号：ECL-0012）；MEM(EBSS)培养基（中国医学科学院基础医学研究所）；胎牛血清（美国Gibco 公司，货号：10099141）、0.25%EDTA 胰蛋白酶（美国Gibco 公司，货号：25200056）。电泳仪DG-300C（北京鼎国昌盛生物技术有限公司）；酶标仪ZS-3（北京市新风机电技术公司）；迷你双垂直电泳槽DYCZ-24DN、迷你转印电泳槽DYCZ-40D（北京市六一仪器厂）；摄像装置及成像软件系统（麦克奥迪实业集团公司）。

1.4 方法

1.4.1 造模及分组 SiHa 细胞株经过复苏、培养、传代、生长良好的细胞进行冻存。造模前取对数生长期的SiHa 细胞，常规消化，用MEM（EBSS）=培养基重悬清洗，离心2 遍，1000 r/min，5 min（离心半径157 mm），计数，制成浓度为2×107/mL 的细胞悬液，放置于冰上转运，备用。取雌性5 周龄裸小鼠，用1 mL 注射器抽取充分混匀的细胞悬液，注入裸小鼠右前腿外上方皮下，0.2 mL/只。细胞悬液注入后可见以注射部位为中心的圆形隆起，每天观察记录注射区域变化，以注射部位出现平均直径≥0.5 cm 质硬肿物为造模成功。成功后计算肿瘤体积大小，将肿瘤体积进行编号，运用随机数字表将荷瘤小鼠分为五组，每组10 只。即模型组、卡波姆940 组、中药组、顺铂组及联合用药组（卡波姆为凝胶中的辅料，故设置该组）。

1.4.2 给药 造模后，模型组常规饲养；中药组于成瘤部位给予清热除湿凝胶外涂（每天每50 mm3瘤体体积外涂凝胶0.3 mL）；顺铂组：将10 mg 顺铂溶于66.7 mL生理盐水中制成顺铂注射液腹腔注射（每10 g 体重注射0.2 mL，每3 天注射1 次）；卡波姆940 组：卡波姆940 外涂（每天每50 mm3体积外涂0.15 mL）；联合用药组：同时给予中药外涂和顺铂腹腔注射，方法剂量同前；各给药组均给药28 d。

1.4.3 取材及标本制备 实验结束后，取材前12 h 动物禁食不禁水，1%戊巴比妥钠0.1 mg/g，腹腔注射麻醉。剥取小鼠的肿瘤组织，称重、拍照后，取1/2 组织分装入冻存管，继而放入液氮中保存，用于Western blot 蛋白检测细胞凋亡检测。另一部分放入甲醛中固定，用于后续其他实验。

1.5 结果判定

凋亡检测：肿瘤组织切片经脱蜡、酒精水化等处理后每片滴加100 μL 1×Equilibration Buffer（按1∶5 的比例用去离子TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒附带）使其全部覆盖待检样本区域，充分反应后甩干，滴加缓冲液，进入暗室，冲洗，滴加PI 溶液，甘油封片，荧光显微镜下观察剥离下的小鼠肿瘤组织切片（200×），染色为绿色的点为阳性细胞，随机取5 个不重复的视野，对阳性细胞进行计数，取均值，进行统计分析。计算细胞凋亡指数（apoptotic index，AI），AI（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%。

Western blot 蛋白检测：取50～100 mg 肿瘤组织，加入RIPA 裂解液，冰上匀浆，4℃离心12 000 r/min，10 min，离心半径6.2 cm。取上清，分装，置于-80℃保存备用。配制适量BCA（A 液∶B 液=50∶1）工作液测定蛋白浓度，蛋白电泳（80 V 恒压电泳）及转膜（恒压80 V转移3 h）后分别按试剂说明书加入一抗和二抗（1∶2000 稀释），检测Bax、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3 蛋白。用Quantity One 图像分析软件读取目标条带的光密度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 24.0 统计学软件对数据进行分析。符合正态分布计量资料采用均数±标准差（）表示，采用单因素方差分析，进一步两两比较，采用LSD-t 或Dunnett’s 检验。计数资料采用例数或百分比表示。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 药物干预对肿瘤组织凋亡的影响

与模型组、卡波姆940 组比较，中药组、顺铂组、联合用药组细胞凋亡率均有升高，以联合用药凋亡率最高，差异有统计学意义（P ＜0.05）；而卡波姆940 组与模型组细胞凋亡率比较，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1～2。

图1 药物干预后各组肿瘤组织细胞凋亡情况

图2 药物干预后各组肿瘤组织细胞免疫荧光TUNEL 凋亡图（200×）

2.2 药物对肿瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响

与模型组、卡波姆940 组比较，中药组、顺铂组、联合用药组Bax、Caspase-3 表达均上调，Bcl-2 表达均下降，且联合用药组表达最明显，差异有统计学意义（P ＜0.05）。与模型组、卡波姆940 组比较，顺铂组、联合用药组Caspase-9 表达上调，差异有统计学意义（P ＜0.05）。见图3～4。

3 讨论

宫颈癌严重威胁女性健康，是目前病因较清楚的女性恶性肿瘤，即与宫颈HPV 感染有关，尤其高危型HPV16 型和18 型致病风险最高[3]。诸多研究致力于寻找具有抑瘤作用或者抑制HPV 病毒的有效药物从而防治宫颈癌。清热除湿凝胶由紫草、金银花、苦参、黄柏、莪术、白及等多味中药组成，全方清热除湿，敛疮止带，杀虫止痒。方剂来源于北京中医药大学东直门医院名老中医的治疗宫颈炎症的散剂经验方，经过本团队对药味进行加减优化、剂型改良制成凝胶制剂，课题组前期经过几年的研究发现清热除湿凝胶外用有较好的HPV 转阴率，改善患者宫颈炎、宫颈HPV感染临床症状、影响患者免疫功能；凝胶及其中部分单体成分体外动物实验能够抑制裸鼠SiHa 细胞移植瘤增殖、促进肿瘤细胞凋亡等多方面作用[4-10]。本研究对其体外促进肿瘤细胞凋亡及其机制进一步研究。

图3 药物干预对肿瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响

图4 药物干预对肿瘤组织凋亡相关蛋白表达的影响

细胞凋亡是细胞自主性、程序性的死亡，正常凋亡能够有效地清除基因异常或衰老细胞，是机体在细胞层面优胜劣汰新陈代谢的过程。越来越多的研究证实肿瘤的发生是细胞增殖与凋亡之间的动态平衡被打破的结果，使一些该正常凋亡的细胞逃离凋亡，甚至过度增殖而成为肿瘤细胞。细胞凋亡分为细胞表面受体的外部凋亡途径和线粒体介导的内在凋亡途径[11]。本研究发现凝胶外涂能够提高裸小鼠HPV16 阳性宫颈癌细胞移植瘤组织的细胞凋亡率，中药组与模型组及其凝胶中辅料卡波姆940 组比较差异有统计学意义（P ＜0.05）。而且清热除湿凝胶外涂还能上调小鼠移植瘤肿瘤组织中线粒体凋亡相关蛋白Bax、Caspase-3、Caspase-9 水平，下调Bcl-2 水平。注射化疗药物顺铂也有此作用，且顺铂与中药外涂联合用药作用最强。考虑中药凝胶发挥促进肿瘤细胞凋亡的机制可能与线粒体内在凋亡途径有关。线粒体凋亡途径是Bcl-2 蛋白家族、半胱氨酸蛋白酶（Caspase 家族）及线粒体膜结构变化等诸多环节共同构成的一个复杂的凋亡网络[12]。在细胞凋亡信号的诱导下，线粒体外膜通透性发生改变或者被破坏，使本身在线粒体内的物质如细胞色素C（CytC）、凋亡诱导因子（AIF）、核酸内切酶G 等穿过线粒体膜进入细胞质中，导致线粒体功能的丧失，细胞凋亡程序启动，随后引起一些列级联反应，其中CytC 对线粒体损伤最为严重，使线粒体迅速丧失功能，最终引起Caspase 的活化，使DNA 降解，细胞凋亡[13-15]。Bax/Bcl-2 家族以及Caspase 系列蛋白是线粒体凋亡途径中的重要凋亡相关蛋白。Bax为促凋亡蛋白代表，Bcl-2 为抑凋亡蛋白代表。Bcl-2/Bax 比值改变被认为是细胞凋亡逃逸的主要机制[16-17]。Caspase 是触发细胞凋亡的关键蛋白家族，也是线粒体凋亡途径的重要参与者[18]，上游凋亡始动因子Caspase-9和下游凋亡效应因子Caspase-3 是其中相对重要的蛋白酶，在其他Caspase 凋亡辅助因子辅助下参与细胞凋亡过程。已有研究证实宫颈癌及癌前病变组织中的Bcl-2 表达水平明显高于正常宫颈组织[19]，且能通过促进Caspase-3 表达而达到抑制宫颈癌细胞增殖作用[20-21]。本研究发现清热除湿凝胶能上调肿瘤组织中促凋亡蛋白Bax，下调抑凋亡蛋白Bcl-2，从而进一步影响Caspase 家族，上调了Caspase-9 和Caspase-3，使肿瘤细胞凋亡率升高，这可能是药物发挥抑瘤作用和促进肿瘤细胞凋亡的部分机制。

凝胶中的药物成分多数为具有清热燥湿、清热解毒、杀虫止痒敛疮作用的中药。相关研究也发现清热类中药能够影响肿瘤性疾病的细胞凋亡[22-25]，为本研究中药的作用提供佐证和研究支持，对药物进一步研究开发和药味拓展也奠定一定基础。另外，本研究发现与中药组和顺铂组比较，中药与顺铂联合作用，其促进肿瘤细胞凋亡、上调促凋亡蛋白Bax 下调抑凋亡蛋白Bcl-2 的作用均最强，提示中药与顺铂有协同增效作用，与相关研究的结论类似[26]。药物的具体机制和与抗肿瘤西药的联合作用等尚有待于更深层次的进一步研究。