不同剂量藏红花提取液对大鼠慢性高眼压模型视神经及轴浆流的影响

于敬妮 杨新光 杨尚飞 龚 珂 汪晓瑜

西安市第四医院眼科，陕西西安 710004

青光眼是一组以视神经萎缩和视野缺损为共同特征的疾病，为全球第一位不可逆致盲眼病[1]。而青光眼性视神经损伤是其核心问题，也是最终病理结局，组织学改变为视网膜神经节细胞（retina ganglion cells，RGCs）凋亡、神经轴突、细胞损伤及轴浆流受阻等[2-3]。研究证明[4]青光眼性视神经损伤，筛板挤压，伴有视觉通路上外侧膝状体及初级视皮质的跨突触神经元变性，轴浆流受损，导致微循环改变、神经营养因子缺乏，视神经进一步损伤。有报道藏红花可以改善微循环和清除氧自由基，对缺血再灌注损伤模型有神经保护作用[5]。本课题组曾观察到藏红花提取液对兔高眼压造成的视网膜节细胞减少及视功能损伤具有保护作用，推测与其改善微循环、抗氧化等效应有关。为了进一步了解藏红花对慢性高眼压视神经损伤的作用，本研究经上丘荧光金逆行标记、视神经光镜及透射电镜等检查，观察了藏红花提取液对大鼠慢性高眼压模型视神经及其轴浆流的影响，为其临床应用提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

0.5 %盐酸丙美卡因滴眼液及妥布霉素地塞米松眼膏（16D04BA 15 mL 及OFTL1A 3.5 mg，美国爱尔康公司）；藏红花由第四军医大学口腔医院药剂科提供。TonopenⅡ眼压计（美国MedtronicsALON 公司）；光学显微镜（CX23 日本奥林巴斯株式会社）；透射电子显微镜（H-9500 日本日立株式会社）；荧光金染色剂（美国罗氏公司）。

1.2 藏红花提取液的配制

藏红花150 g，蒸馏水煮沸30 min 过滤2 次，浓缩，3 倍量950 mL/L 乙醇沉淀24 h，过滤，减压蒸馏，稀释成100 mL 装瓶，灭菌。用水稀释成50 g/L[6]。

1.3 实验动物

32 只SPF 级健康成年雄性SD 大鼠，9～10 周龄，体重250～300 g，由西安交通大学医学院实验动物中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（陕）2016-0018，合格证号22-9601018，并通过西安交通大学医学院动物伦理委员会审查。排除眼部疾病，在避光、安静，22～24℃，湿度50%～60%的环境下饲养。

1.4 慢性高眼压模型的建立及药物干预

32 只大鼠，以随机数字表法分为高眼压组、对照组、低剂量组和高剂量组，每组8 只，16 只眼。参考Shareef 等[7]的方法：大鼠用4%水合氯醛麻醉，0.5%盐酸丙美卡因滴眼液表面麻醉，角巩膜缘8∶00～1∶00 位剪开球结膜，暴露4 条表浅巩膜静脉，大头针灼烧颞侧、颞上、颞下静脉；对照组仅剪开球结膜。术后妥布霉素地塞米松眼膏涂眼。TonopenⅡ眼压计测眼压，术后眼压>22 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa）为造模成功。于术前和术后l d、3 d、l 周、2 周、3 周、4 周测眼压，连测3 次，取平均值。测后用妥布霉素地塞米松涂眼。术前30 min 及术后每日10∶00～11∶00，按低剂量组、高剂量组大鼠腹腔分别注射藏红花提取液20 mg/kg（0.5 mL）和80 mg/kg（2 mL）；高眼压组和对照组注射生理盐水0.5 mL，1 次/d，连续28 d。

1.5 标本制备及观测

造模成功并给药第25 天，大鼠深度麻醉下，固定在脑立体定位仪上，0.5%碘伏消毒，沿正中线切开颅顶皮肤向下分离达颅骨，按照Paxinos 大鼠脑定位图谱[8]定位双侧上丘。钻开颅骨相应部位，取3%荧光金，每侧上丘注射两点（深4.0 mm），每点注射1.5 μL，留针5 min。3 d 后，麻醉致死，12 点处做球结膜缝线标记，取出眼球及视神经。

眼球固定于4%多聚甲醛磷酸2 h，角膜缘后0.5 mm剪开眼球，去除角膜和晶状体，分离视网膜并定向平铺，干燥，封片。荧光照片RGC 计数，在荧光显微镜下用V 波段荧光激发，距视盘中心2 mm 上下左右拍照，照片放大150 倍。以MoticMed 6.0 数码医学图像分析系统分析（每张切片随机取6 个视野，每个视野0.2 mm×0.2 mm，视神经两侧各取4 个视野），计数标记细胞。

视神经分为球后1～2 mm 处的A 段和2～3 mm处的B 段。A 段用25 mL/L 戊二醛的磷酸盐固定1 h，10 mL/L 锇酸固定，脱水，包埋，切1 μm 厚半薄切片，甲苯胺兰染色，定位，再切成50 nm 的超薄切片。醋酸双氧铀和枸橼酸铅双重染色后在电镜下观察，计数视神经轴突，每个标本取10 个方位，每个方位3 个视野，求平均值分析。B 段在40 mL/L 多聚甲醛后固定20 min，200 mL/L 蔗糖浸泡至下沉，Tissu-Tek 包埋，冰冻切片，片厚18 μm，置于-20℃，HE 染色观察视神经情况。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 统计学软件对所得数据进行分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 检验，两组间比较采用t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 光镜下视神经的形态

对照组：视神经细胞数量丰富，纤维排列整齐（图1A）；高眼压组：视神经色淡，细胞数量很少，纤维排列紊乱（图1B）；低剂量组：细胞数量有所增加，纤维排列较整齐（图1C）；高剂量组：细胞数量、纤维排列接近对照组（图1D）。

2.2 视神经超微结构

图1 视神经横断面HE 染色（20×）

对照组：视神经轴突排列整齐，髓鞘、轴膜完整，轴索里细胞器丰富（图2A）。高眼压组：髓鞘间隙增大，结缔组织过度增生，轴索里线粒体变性，微丝、微管崩解，轴膜髓鞘分离，沃勒变性（图中红箭头），节段性脱髓鞘（图中黑箭头），轴突萎缩（图中蓝箭头）（图2B）。低剂量组：轴突结构破坏及数量明显改善，但轴膜厚度不一，仍有脱离（图2C）。高剂量组：轴突排列较整齐，髓鞘稍薄，轴膜完整，轴索里微管等细胞器丰富（图2D）。

图2 电镜下视神经轴突（6000×）

图3 视网膜逆行荧光金染色（150×）

视神经轴突计数：与对照组比较，高眼压组轴突数量减小，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），与高眼压组比较，低剂量组和高剂量组轴突数量增多，差异有高度统计学意义（P ＜0.01），与低剂量组比较，高剂量组轴突数量增多，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表1。

2.3 逆行荧光金标记节细胞

对照组：标记RGCs 各象限分布均匀，视盘旁密度高，周围区密度降低，血管自视盘放射状分布，血管走形区无RGCs，细胞形态多为圆形，部分见轴突，荧光在细胞质，细胞外未见荧光金渗漏（图3A）。高眼压组：RGCs 各区域密度低，分布不规律，细胞质荧光金不均匀，部分荧光金渗漏，未见轴突显现（图3B）。低剂量组：RGCs 数目增多，荧光增强，边界清晰，个别细胞可见突起（图3C）。高剂量组：RGCs 数目丰富，荧光显著增强，无渗漏，血管呈放射状，其走行区无标记细胞，部分突起清晰可见（图3D）。

表1 四组视神经轴突计数比较（个，）

表1 四组视神经轴突计数比较（个，）

注：与对照组比较，aP ＜0.01；与高眼压组比较，bP ＜0.01；与低剂量组比较，cP ＜0.01

逆行荧光金标记节细胞计数：与对照组比较，高眼压组节细胞数量减小，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与高眼压组比较，低剂量组和高剂量组节细胞数量增多，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）；与低剂量组比较，高剂量组节细胞数量增多，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见表2。

表2 四组逆行荧光金标记节细胞数量比较（个/mm2，）

表2 四组逆行荧光金标记节细胞数量比较（个/mm2，）

注：与对照组比较，aP ＜0.01；与高眼压组比较，bP ＜0.01；与低剂量组比较，cP ＜0.01

3 讨论

随着高眼压的持续，视网膜缺血缺氧时间的延长及机械压力的持续存在，节细胞缺血受损，其轴突构成的视神经也损伤、变性，导致视神经轴浆流受阻，聚集在筛板区，此时线粒体产生的腺苷三磷酸无法被轴突膜利用，致使轴突蛋白的生成和移动大幅度减少，视网膜代谢受到影响进而导致节细胞凋亡[9-11]；同时，持续高眼压使筛板中的环绕视神经束向后扭曲、变形，筛板受损，直接压迫靠近胶原纤维的轴突，使轴浆流受到阻滞，靶组织的营养供给中断[12]，神经通路受阻，影响神经轴浆流运输，共同导致视网膜神经节细胞凋亡[13-14]。解剖上视神经由RGCs 的轴突汇聚而成，软脑膜组织紧贴围绕在视神经周围，发出结缔组织与神经胶质构成微小间隔，将视神经隔成神经纤维束，形成髓鞘，其间富含细胞器。本研究中光学显微镜及透射电子显微镜观察可见，高眼压组轴突数量及结构破坏明显。低剂量组轴突数量、神经髓鞘崩解和轴突变性程度均有所改善，而高剂量组神经结构损伤显著改善，更接近于对照组。

以往研究[3,15]表明高眼压等因素损伤视神经，神经系统出现脱髓鞘改变后，裸露的轴膜更易打开电压门控钙通道，钙离子内流增多致轴突损伤，同时，脱髓鞘导致轴突内蛋白骨架破坏，出现沃勒变性，另外，在缺血性改变外，单纯沃勒变性也会诱导氧化应激，诱导并启动凋亡信号通路，造成神经细胞的凋亡[16]。而现代药理学已证实藏红花有改善血液循环、抗氧化、调控钙离子通道，影响信号通路、抗凋亡、保护神经等作用[17-18]，在眼部及视神经保护方面也屡有报道[19-21]。本研究显示高眼压组视神经破坏明显，出现一系列结构及数量改变，而高剂量组，结构损伤性改变明显好转，几乎接近于对照组，说明藏红花提取液对视神经损伤有改善作用，而高剂量作用显著。

视网膜节细胞是视网膜中唯一能与大脑中枢发生神经系统信息传递的细胞[22]，也是青光眼等病变的靶细胞，RGCs 的准确计数是目前国际上公认的评价视神经损伤程度的重要形态学指标[23-24]；荧光金是一种性质稳定、灵敏度高的荧光示踪剂，广泛应用于神经细胞的标记，其标记的RGCs 呈金黄色强荧光。荧光金标记细胞质，而细胞核不着色，能很好地显示树突分支，细胞外无荧光染料渗漏，与周围组织分界清晰，除RGCs 层外，其余各层均无荧光标记，除能很好地标记RGCs，还能计数RGCs，反映轴浆流情况，也能耐受多种组织学染色处理，不易粹灭[25]。本研究利用大鼠慢性高眼压模型，以荧光金做为标志物，利用轴浆流运输逆行标记RGCs，观察和评价藏红花对慢性高眼压损伤后RGCs 的存活情况，反映其对视神经轴浆流的影响。结果显示：对照组荧光金可通过神经传导通路，利用轴浆逆行传导，很好地标记RGCs。高眼压组，标记细胞数量稀疏，荧光金被大部分阻断，轴浆逆行传导被破坏。低剂量组轴浆逆行传导改善，而高剂量组细胞数量增多，形态显著改善，甚至接近对照组。由此不难看出，藏红花对视神经轴浆流有显著改善作用，从而营养视神经，保护视网膜神经节细胞，改善视神经组织及超微结构，进而保护视神经。当然藏红花对视神经损伤的作用也不仅限于本研究，其更深层次的作用机制，还需要进一步深入研究证明。