利拉鲁肽保护链脲霉素致糖尿病大鼠心肌损伤的机制

费 龙，马浩然*，毛晓丽，文 煜(.武汉市第一医院药学部，武汉 4300；.武汉音乐学院医疗中心，武汉 430000)

糖尿病心肌病是糖尿病的一种主要慢性并发症，心肌纤维化是其主要病理特征，心肌成纤维细胞的大量增殖、基质蛋白及胶原蛋白的大量沉积是导致心肌纤维化和糖尿病心力衰竭的主要原因[1-2]。糖尿病心肌病的发病机制复杂、代谢紊乱、心肌纤维化和心脏自主神经病变等均是其可能的影响因素[3]。胰高血糖素样肽(GLP-1)是有末端空肠、回肠及结肠L细胞分泌的一类多肽，通过与其受体结合具有显著的降血糖功效，但其半衰期过短，仅为2 min[4]。利拉鲁肽作为一种GLP-1类似物，其半衰期较长，可促进GLP-1受体胰高血糖素样肽1受体(GLP-1R)的表达升高[5]，对糖尿病心肌损伤具有保护作用[6]。本研究采取高糖高脂饲料饲养联合注射链脲霉素(STZ)构建糖尿病模型，并用不同剂量的利拉鲁肽进行干预，研究利拉鲁肽保护糖尿病心肌损伤的可能机制，以期为临床预防及延缓糖尿病心肌病提供新思路。

1 仪器与材料

1.1仪器 ACCU-CHEK型快速血糖测定仪(罗氏公司)；Image Master VDS型凝胶自动成像仪(瑞典Pharmacia公司)；BX 51型光学显微镜(日本Olympus公司)；H-7500型透射电镜(日本Hitachi公司)。

1.2试药 利拉鲁肽( 规格：3 mL∶18 mg，批号P63001)，丹麦诺和诺德公司；链脲霉素(STZ，批号2101605)、甲醛和戊二醛，均购于美国Sigma-Aldrich公司；枸橼酸钾缓冲液，湖北百奥斯生物科技有限公司；水合氯醛，上海雅吉生物科技有限公司；醋酸双氧铀和柠檬酸铅，德国默克公司；高糖高脂饲料，辽宁长生生物技术有限公司；磷酸盐缓冲液(PBS)，总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒及荧光定量PCR试剂盒(批号分别为20170309，20170413，20170316)，赛默飞世尔科技有限公司；Ⅰ型胶原蛋白(Col-1)、转化生长因子-β1(TGF-β1)的引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；兔抗鼠模型微管相关蛋白1轻链3(LC3B)、克隆人微管相关蛋白1轻链3-β-Ⅰ(LC3-Ⅰ)、克隆人微管相关蛋白1轻链3-β-Ⅱ(LC3-Ⅱ)，选择性自噬接头蛋白(p62)，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)，磷酸化AMPK(P-AMPK)，哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(P-mTOR)和GAPDH抗体，美国Abcam公司。

1.3动物 清洁级雄性SD成年大鼠40只，体质量为200～260 g，购于中国食品药品检定研究院[许可证号：SCXK(京)2014-0013]，培育室温度为20～25 ℃，湿度保持在65%～70%，人工光照(每12 h昼夜交替1次)，自由饮水，常规饲料饲养。

2 方法

2.1实验动物分组及模型的制备 将40只SD大鼠随机分为正常组(10只)和造模组(30只)。适用性饲养5 d后，造模组给予高糖高脂饲料，正常组常规饲养。8周后，造模组禁食不禁水，一次性腹腔注射STZ 30 mg·kg-1，正常组给予等量枸橼酸钾缓冲液。注射72 h后尾静脉采血用ACCU-CHEK快速血糖测定仪测定随机血糖，血糖含量≥16.7 mmol·L-1判定为造模成功[7]。造模后继续高糖高脂饲料饲养6周(饲养过程中死亡3只)，最终纳入27只糖尿病模型大鼠，随机分为模型组和利拉鲁肽高、低剂量组，各9只，利拉鲁肽高、低剂量组大鼠分别于早晚7点腹腔注射利拉鲁肽200,50 μg·kg-1，正常组和模型组注射等量生理盐水，共干预8周。

2.2样本采集及处理 末次给药24 h后，用10 g·L-1水合氯醛麻醉大鼠后取血，用于生化及血脂指标检测，取血完成后断头处死大鼠，于冰上打开胸腔，迅速取出心脏，用4 ℃生理盐水冲洗干净，清除心脏外组织后称定心脏质量，计算心肌肥厚指数(HWI=心脏质量÷体质量)；取部分左心室组织，部分用40 g·L-1的甲醛固定，进行常规脱水、包埋、切片后用于心肌组织病理学检测；剩余组织用40 g·L-1的戊二醛固定，进行常规脱水、包埋后制备超薄切片用于电镜观察；另取部分心肌组织，放入消毒灭菌过的RNase Free研钵中加入液氮研磨成粉末，保存于RNase Free的离心管中，液氮迅速冷冻后保存于-80 ℃超低温冰箱用于qRT-PCR和Western Blot检测。

2.3光镜下观察大鼠心肌组织病理学形态 取2.2项下制备好的切片，常规脱蜡脱水后，进行HE染色，利用Olympus光学显微镜观察心肌组织形态结构。

2.4电镜下观察心肌组织中自噬小体超微形态观察 取2.2项下制备的切片，用PBS浸洗2～3次，进行梯度乙醇脱水处理，用超薄切片机切成1 μm的薄片进行观察定位后，继续切取75 nm的超薄切片，用醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在H-7500型透射电镜下观察并拍照记录，采用Image Pro Plus 6.0软件进行自噬小体超微形态观察及计数。

2.5免疫组化检测心肌组织中LC3B蛋白的表达水平 采用免疫组化处理2.2项下制备好的切片，置于光镜下观察。采用Image Pro Plus 6.0软件对各组织400倍下的3张照片进行积分光密度(IOD)分析，计算平均光密度值(AOD)。

2.6qRT-PCR法检测心肌组织中Col-1和TGF-β1的mRNA表达水平 按照总RNA提取试剂盒说明书上的操作步骤提取各组大鼠心肌组织中的总RNA。按照反转录试剂盒说明书进行cDNA的合成。PCR反应参数设置：50 ℃激活聚合酶5 min，95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火和延伸34 s，反应进行40个循环。溶解曲线绘制：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，85 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s。各孔设置3个复孔。用2-△△Ct法计算mRNA的表达量。引物信息：Col-1(上游引物：5′-TTCACCTACAGCACGCTTGT-3′；下游引物：5′-TTGGGATGGAGGGAGTTTAC-3′，长度196 bp)；TGF-β1(上游引物：5′-ACCAGTTCCCAGAGGTGTATGT-3′；下游引物：5′-TTGGGACAGAAGTGCTTGACTTC-3′，长度244 bp);GAPDH(上游引物：5′-GATGGGTGTGAACCACGAGAAA-3′；下游引物：5′-ACGGATACATTGGGGGTAGGAA-3′，长度330 bp)。

2.7Western Blot法检测心肌组织中LC-3Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR的蛋白表达水平 取心肌组织上清液，采用Bradford调整各组蛋白浓度一致，经SDS-PAGE凝胶电泳、电转膜至甲醛预处理过的PVDF膜，密封2 h，加入兔抗鼠LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p62、P-AMPK、AMPK、P-mTOR、mTOR和GAPDH(1∶1 000)一抗4 ℃孵育过夜，TBST漂洗40 min，加入HRP标记的二抗(1∶500)孵育1 h，TBST漂洗40 min，ECL发光液将PVD膜显色，暗室曝光到X线片上，采用Imaging System软件分析各组条带灰度值，以目标蛋白与内参积分吸光度值的比值表示蛋白表达水平。

3 结果

3.1利拉鲁肽对糖尿病大鼠HWI及生化指标的影响 见表1。由表1可知，与正常组相比，模型组大鼠的HWI、FPG、FINS、TC和TG水平均显著升高，而利拉鲁肽干预后上述指标均显著降低，差异均有统计学意义(P<0.05)。

表1 各组大鼠HWI及生化指标比较

3.2利拉鲁肽对糖尿病大鼠心肌组织损伤的影响 见图1。由图1可知，正常组大鼠心肌细胞排列整齐，心肌间质少，细胞核大小及胞浆染色均匀；模型组大鼠心肌细胞肿胀，细胞分布散乱，排列紊乱，且间质明显增多，胞浆染色较浅，部分细胞核显著增大；利拉鲁肽高、低剂量组心肌细胞肿胀及结构散乱情况明显减轻，染色较为均匀，且利拉鲁肽高剂量组干预效果更佳。

3.3利拉鲁肽对糖尿病大鼠心肌组织中自噬小体数量及LC3B蛋白表达的影响 见图2、图3和表2。由图2和表2可知，与正常组相比，模型组小鼠心肌组织中自噬小体数量显著降低，利拉鲁肽高、低剂量组自噬小体数量显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)；由图3和表2可知，与正常组相比，模型组小鼠心肌组织中LC3B蛋白的AOD显著降低，利拉鲁肽高、低剂量组AOD水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 各组大鼠心肌组织HE染色结果(×400)

图2 各组大鼠心肌组织透射电镜观察结果(×10 000)

图3 各组大鼠心肌组织LC3B免疫组化结果(×400)

表2 各组大鼠心肌组织中自噬小体数量及LC3B蛋白表达比较

3.4利拉鲁肽对糖尿病大鼠心肌组织中Col-1和TGF-β1的mRNA表达水平的影响 见表3。由表3可知，与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中Col-1和TGF-β1的mRNA表达水平均显著升高，利拉鲁肽高、低剂量组Col-1和TGF-β1的mRNA表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表3 各组大鼠心肌组织中Col-1和TGF-β1的mRNA表达水平

3.5利拉鲁肽对糖尿病大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表达的影响 见图4和表4。由图4和表4可知，与正常组相比，模型组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平均显著降低，p62和mTOR磷酸化水平均显著升高，利拉鲁肽干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平显著升高，p62和mTOR磷酸化水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

表4 各组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表达比较

图4 各组大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ、p62、AMPK和mTOR蛋白表达图谱

4 讨论

本研究通过采用高糖高脂饲料联合STZ腹腔注射的方法构建了糖尿病大鼠模型[8]，研究发现，与正常组大鼠相比，模型组大鼠HWI显著升高，而体质量显著降低，表明糖尿病模型建立成功。糖尿病心肌病作为一种慢性且不可逆转的心脏并发症，心肌间质纤维化是其特征性病理表现，可引起左心室舒张及收缩功能障碍，最终发展为心力衰竭[9-10]。本研究通过HE染色观察发现，糖尿病大鼠心肌组织结构排列紊乱，有局灶性坏死情况发生，且心肌细胞间质中成纤维细胞明显增多，细胞间隙也显著增大，而透射电镜下可发现自噬小体数量显著减少，免疫组化结果显示，自噬标志性蛋白LC3B的蛋白表达显著降低，而利拉鲁肽干预后，能够有效改善心肌纤维化程度，并增加自噬小体数量及LC3B蛋白表达水平，表明利拉鲁肽具有保护糖尿病心肌损伤的作用，可能是通过调控自噬过程来完成的。

TGF-β1是促成纤维化的关键因子，其通过激活TGF-β1/Smad信号转导途径，诱导胶原合成[11-12]。Col-1作为信号转导途径的下游信号因子，被激活后能够调控细胞外基质的合成并抑制其降解，从而引起心肌组织处的细胞外基质过度沉积，而心肌纤维化与细胞外基质过度沉积关系密切[13]。本研究结果显示，糖尿病大鼠心肌组织中Col-1、TGF-β1的mRNA表达水平显著升高，而经过利拉鲁肽干预后，Col-1和TGF-β1的mRNA表达水平降低，表明利拉鲁肽可能是通过抑制促纤维化因子的表达而发挥抗心肌纤维化作用的。Dalsgaard N B等[14]研究发现，利拉鲁肽作为GLP-1的类似物，通过促进GLP-1R合成，并与之结合，能够与心、脑血管上的多个靶点相互作用，减少心肌细胞凋亡、抗心肌纤维化及保护内皮功能，与本研究结果类似。

自噬是一种高度保守的细胞行为，在细胞生长发育、成熟分化和细胞免疫等方面均发挥着重要作用，被称为Ⅱ型程序性死亡[15]。自噬通过清除和降解自身受损细胞器及大分子物质，形成一种循环再利用系统，通过其降解产物提供细胞能量、重建细胞结构，实现自身代谢需要，维持细胞稳态功能[16]。AMPK是感知细胞能量状态的重要激酶，其在细胞生长、自噬和凋亡过程中均发挥着重要作用[17]，活化的AMPK能够磷酸化下游效应因子mTOR从而抑制细胞自噬[18]，人微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)和p62是细胞自噬过程的2个标志性蛋白，当细胞发生自噬时，磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/Akt)信号途径会激活mTOR，促进LC3-Ⅰ转化为LC3-Ⅱ，同时还会泛素化p62激活细胞的选择自噬性降解[19-20]。本研究结果显示，糖尿病大鼠心肌组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平显著降低，p62和mTOR磷酸化水平均显著升高，表明糖尿病引起的代谢紊乱能够通过抑制AMPK激活从而降低机体自噬水平，进而加重心肌损伤，而利拉鲁肽干预后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和AMPK磷酸化水平显著升高，p62和mTOR磷酸化水平显著降低，表明利拉鲁肽可能是通过激活AMPK，抑制mTOR信号转导途径，促进心肌组织的自噬过程，减轻心肌纤维化，进而减轻心肌损伤。

综上所述，利拉鲁肽作为一种GLP-1类似物，除了可以调节糖脂代谢外，还可发挥抗糖尿病心肌病的保护作用，其作用机制可能是通过下调促纤维化细胞因子减少Col-1合成，同时促进AMPK蛋白磷酸化，抑制mTOR磷酸化来增强细胞自噬从而改善糖尿病心肌组织纤维化病变。