基于TLR4/MyD88/NF-κB通路研究愈疡胶囊抗中耳炎的作用

罗伦才，童 妍，张兴国，陈 礴，钟振东(.凉山彝族自治州第二人民医院，西昌 65000；.西南交通大学生命科学与工程学院药学系，成都 600；．四川省医学科学院,四川省人民医院实验动物研究所，成都 60000)

中耳炎(OM)是儿童常见的上呼吸道细菌感染疾病，也是导致传导性听力损失的主要原因[1-2]。OM是慢性炎症，表现为中耳裂处黏液性积液的积累。愈疡胶囊是凉山彝族自治州第二人民医院(以下简称我院)特色制剂，该制剂对OM、鼻窦炎、术后感染和窦道等外科感染性疾病均具有显著疗效。本研究拟使用愈疡胶囊对细菌感染性OM进行实验，探讨其体内外抗菌抗炎效果及相关机制，为寻找治疗OM的药物做基础研究。

1 仪器与材料

1.1仪器 DSX-30型手提式高压蒸汽灭菌器(上海申安医疗器械厂)；W-CJ-2F型净化工作台(苏州博莱尔净化设备有限公司)；BA400 Digital型数码三目摄像显微镜(麦克奥迪实业集团有限公司)；Image-Pro Plus 6.0型图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)；Spectra MAX Plus384型酶标仪(美谷分子仪器有限公司)。

1.2试药 愈疡胶囊(批号190901，规格：0.45 g·粒-1，1 g药粉相当于原生药1.5 g)，我院自制；左氧氟沙星(批号DW15201，规格：0.5 g·片-1)，购自第一三共制药(北京)有限公司；MH培养基(批号028040)，购自广州环凯微生物科技有限公司；白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白G(IgG)的Elisa试剂盒(批号：ZC-36391，ZC-36404，ZC-37624，ZC-37000，ZC-37002)，均购于上海茁彩生物科技有限公司。Toll-样受体4抗体(TLR4，批号A5258)和β-actin抗体(批号AC026)，购于武汉爱博泰克生物科技有限公司；髓样分化蛋白-88抗体(MyD88,批号ab2064)，p-NF-κB抗体(批号ab86299)和生物素化山羊抗兔IgG(批号ab6721)，均购于英国艾博抗(上海)贸易有限公司。

1.3动物 SPF级SD大鼠，雌雄各半，体质量为(230±20)g，由成都达硕实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(川)2015-030。

2 方法

2.1菌悬液的制备 将肺炎链球菌置于MH培养基中培养12～18 h，待细菌处于对数生长期后使用无菌生理盐水制备菌悬液，调整为0.5个麦氏比浊度后将浓度稀释为106cfu·mL-1，在30 min内完成接种。

2.2受试药液的制备 取愈疡胶囊微粉10 g，溶于100 mL无菌生理盐水中，即为最高浓度，依次往下倍比稀释8个浓度，备用。

2.3最低抑菌质量浓度(MIC)和最低杀菌质量浓度(MBC)的测定 取2.2项下制备的各浓度受试药液，加入96孔无菌板中，每孔180 μL，各浓度3个复孔。将稀释好的菌悬液每孔20 μL加入孔中。另设阳性对照孔(20 μL菌悬液)、阴性对照孔(MH培养基)与空白对照孔(无菌生理盐水)。将96孔板在37 ℃培养18 h，取出，以肉眼观察无明显细菌生长的孔所对应的稀释度为MIC。取有效抑菌质量浓度的培养液0.1 mL移种至不含药物的牛肉膏蛋白胨琼脂平皿上，置于37 ℃培养箱中培养18 h，肉眼观察细菌生长程度，以培养皿中菌落计数少于5个菌落所对应的药物质量浓度作为MBC。

2.4分组构建大鼠化脓性OM模型及药物干预 将50只大鼠随机分成模型组、阳性对照组(左氧氟沙星20 mg·kg-1)以及愈疡胶囊高、中和低剂量组(600，300，150 mg·kg-1)，每组10只。造模条件：各组大鼠腹腔注射戊巴比妥钠(0.6 g·kg-1)麻醉，用乙醇消毒左侧外耳道。用1 mL无菌注射器抽取菌液，向左耳鼓室内注射肺炎链球菌悬液(1×108cfu·mL-1)50 μL，即造模完毕，大鼠苏醒后全部在安静条件下饲养。除模型组外，各组每日灌胃对应药物(20 mL·kg-1)，模型组灌胃等剂量无菌生理盐水，每日1次，持续14 d。

2.5鼓膜观察 造模后第7天和第14天于手术显微镜下观察大鼠鼓膜色泽、形状及有无穿孔、积液等情况，评估后进行鼓膜评分。鼓膜炎症评分标准：鼓膜正常，无炎症表现，为0分；鼓膜轻度充血，伴轻度内陷，为1分；鼓膜中度充血，伴中度内陷或凸起，并有轻度中耳积液，为2分；鼓膜重度充血和内陷，并有中到重度的中耳积液，为3分；鼓膜穿孔并流脓，为4分。

2.6样本采集 第7天和第14天将大鼠麻醉后进行眼眶静脉丛采血，收集血清，在-80 ℃保存，备用；第14 天采血完成后处死大鼠，取左侧中耳鼓室，分离部分组织加入40 mL·L-1的多聚甲醛，剩余组织在20 mL·L-1的戊二醛中固定，备用，分别用于病理观察与电镜观察。

2.7大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量测定 将采集好的血清按照试剂盒说明书测定IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

2.8大鼠血清中免疫球蛋白IgG和IgA的含量测定 将采集好的血清按照试剂盒说明书测定IgG和IgA含量。

2.9大鼠鼓室组织形态学观察 将固定好的鼓室组织进行包埋切片，使用苏木精-伊红(HE)染料进行染色，在光学显微镜下观察切片，观察鼓室感染情况。

2.10大鼠鼓室组织超微结构观察 取固定好的鼓室组织，使用扫描电镜观察是否出现细菌样大小及形态的物质、是否出现无定形物质(为细胞外多糖构成)包绕细菌以及上述物质是否黏附在黏膜表面，评价细菌生物膜的形成情况。

2.11大鼠鼓膜中TLR4、MyD88和p-NF-κB蛋白的含量测定 用Western Blot法测定大鼠鼓膜中3种蛋白的含量，并计算目的蛋白的相对表达量。

3 结果

3.1愈疡胶囊体外抗菌能力 体外抗菌实验结果显示，愈疡胶囊对肺炎链球菌的MIC和MBC分别为12.5，25.0 g·L-1。

3.2鼓膜表征观察 在第7天和第14天对各组大鼠鼓膜进行观察评分后发现，与模型组相比，阳性对照组和愈疡胶囊高剂量大鼠鼓膜红肿、积液情况较轻，评分显著降低，差异具有统计学意义(P<0.05)。第14天与第7天相比，模型组及愈疡胶囊中、低剂量组鼓膜感染情况均有不同程度加重，阳性对照组与愈疡胶囊高剂量组基本未变。结果见表1。

3.3大鼠血清炎症因子 与模型组比较，阳性对照组与愈疡胶囊高、中剂量组的IL-1β、IL-6和TNF-α含量均减少，差异具有统计学意义(P<0.05)；第14天与第7天相比，各组IL-1β、IL-6和TNF-α含量均有不同程度增加。结果见表2。

表1 鼓膜评分情况

表2 愈疡胶囊对大鼠血清中炎症因子的影响

3.4大鼠血清中免疫指标的测定 与模型组比较，第7天愈疡胶囊高、中剂量组的IgA含量减少，愈疡胶囊高剂量组的IgG含量减少；第14天愈疡胶囊高剂量组的IgA与IgG含量均最低，差异具有统计学意义(P<0.05)。第14天与第7天相比，各组指标均有不同程度增加，结果见表3。

表3 愈疡胶囊对大鼠血清中免疫指标的影响

3.5大鼠鼓室组织病理形态学及超微结构观察 对大鼠鼓室组织切片进行HE染色发现，与模型组相比，愈疡胶囊高、中剂量组OM病变程度减轻，中性粒细胞与坏死细胞数量减少，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表4和图1。对大鼠鼓室组织切片进行扫描电镜观察发现，与模型组相比，愈疡胶囊高、中剂量组听泡黏膜上细菌生物膜形成减少，菌丝分布少，细胞结构完好，结果见图2。

3.6大鼠鼓室组织相关蛋白的测定 与模型组相比，愈疡胶囊高、中剂量组的TLR4、MyD88与p-NF-κB蛋白含量均降低，愈疡胶囊低剂量组中MyD88与p-NF-κB蛋白含量降低，但差异无统计学意义，结果见表5和图3。

表4 大鼠鼓膜病理学评分情况

图1 大鼠鼓室病理形态学结果(HE染色，400×)

Fig.1 Staining results of rat tympanic membrane tissue (HE Staining，400×)

A.model group；B.positive control group；C.Yuyang Capsules high dose group；D.Yuyang Capsules middle dose group；E.Yuyang Capsules low dose group；bule arrow：neutrophile；green arrow：necrotic neutrophil；orange arrow：necrotic epithelial cell.

图2 大鼠鼓室组织电镜观察情况(10 000×)

表5 愈疡胶囊对大鼠鼓膜中蛋白含量的影响

图3 Western Blot检测TLR4、MyD88与p-NF-κB的蛋白含量

4 讨论

OM作为一种常见的儿童上呼吸道疾病，主要包括急性中耳炎(AOM)、渗出性中耳炎(OME)与慢性中耳炎(CSOM)，其中80%的儿童在3岁前经历过AOM发作，其中1/3的患者会经历反复感染，许多发作是由细菌感染引起的[3-4]。OM急性发作会导致咽鼓管功能障碍消失，使渗出液减少转变成慢性或复发性OM，因此细菌是OM反复发作和转变成CSOM的关键[5]。

肺炎链球菌是人类特有的病原体，是引起社区获得性肺炎、OM、菌血症和脑膜炎的主要病原菌，主要位于鼻咽，并通过气溶胶传播到宿主之间，如果细菌存在于生物膜中，则可能通过黏膜分泌物污染而在宿主之间传播[6]。肺炎链球菌、非分型流感嗜血杆菌(NTHi)和卡他莫拉菌是3种全球已知的主要引起AOM的致病菌[7-8]。国际流行病学对拉丁美洲和加勒比人口的研究也确认，肺炎链球菌和NTHi是AOM最常见的细菌病原体[9]。因此，本实验采用鼓室内注射肺炎链球菌构建大鼠OM模型。愈疡胶囊的体外抗菌能力检测发现，愈疡胶囊对肺炎链球菌的MIC和MBC分别为12.5，25.0 g·L-1，计算出用于体内实验的3个剂量分别为600，300，150 mg·kg-1。

鼓膜的状态是评价OM严重程度的重要指标，鼓膜红肿、内陷和渗液等特征可用于直观评价模型的构建与药物的干预效果[10]。使用耳镜对鼓膜进行观察评分后发现，模型组鼓膜出现红肿，部分出现渗液，初步证明模型构建成功。与模型组比较，愈疡胶囊高剂量组鼓膜肿胀程度减轻，基本未出现穿孔、渗液等情况，可初步说明使用愈疡胶囊后导致中耳鼓室渗液减少，能减轻鼓膜病变情况，但其干预机制还需进一步实验说明。

由细菌感染造成的OM会对中耳鼓室造成严重损伤，尤其是鼓室黏膜，而通过对组织进行HE染色与扫描电镜观察可进一步了解损伤情况与药物作用效果。在本实验中，肺炎链球菌感染鼓室后，HE染色观察发现鼓室黏膜内中性粒细胞大量生成，炎性细胞聚集严重，使用愈疡胶囊后情况好转，黏膜得到不同程度的修复。同时扫描电镜结果显示，未经药物处理的鼓室黏膜上存在大量的细菌生物膜，与肺炎链球菌的感染模式相符，使用愈疡胶囊处理后，黏膜上生物膜减少，逐渐恢复正常状态。由此说明，愈疡胶囊能在中耳鼓室产生抑菌抗炎效果。

肺炎链球菌是呼吸道感染疾病的主要致病菌，一旦肺炎链球菌进入中耳，肺炎溶菌素和细胞壁成分就会引发炎症，强烈的炎症是肺炎链球菌致病的标志[11]。肺炎链球菌释放的炎症成分包括肽聚糖、磷壁酸、溶血素、过氧化氢和许多其他分泌的蛋白质[12]，召集来的白细胞吞噬包裹在细胞生物膜中肺炎链球菌是无效的，因为细菌未得到有效清除[11]，只会导致促炎介质的释放增加，如IL-1β、IL-6与TNF-α等[13]。在本实验中发现，与模型组相比，愈疡胶囊高剂量组血清中的炎症因子IL-1β、IL-6与TNF-α含量减少(P<0.05)，14 d后增长缓慢，说明愈疡胶囊能减少因肺炎链球菌引起的炎症反应。当细菌入侵中耳鼓室黏膜时，会引发机体免疫反应，诱导IgA与IgG生成到达病灶发生作用[14]，巨噬细胞和肥大细胞也会释放TNF-α[15]。本实验结果显示，7 d后模型组血清中IgA与IgG大量生成，由于前期以分泌IgA为主，因此IgA的占比较高，符合感染前期趋势。使用愈疡胶囊后，愈疡胶囊高剂量组血清中的IgA与IgG含量较模型组明显下降(P<0.05)，14 d后增长缓慢，可说明愈疡胶囊能降低血清中的炎症与免疫因子，缓解细菌感染所致的症状。

Toll样受体(TLR)是一类模式识别受体，它识别与微生物病原体相关的分子，在先天免疫系统中起关键作用[16]。其中TNF-α可调节TLR通路，调节包括NF-κB[17]，尤其是TLR4的表达[18]。MyD88作为一种受体分子，在细胞表面响应TLR和IL-1β信号时被募集[19]。最新研究表明，TLR4信号通路可通过干预MyD88通路介导细菌感染的OM[20]。因此，寻找抑制TLR4/MyD88/NF-κB途径的新药可能是减轻OM的新方向。本实验使用愈疡胶囊干预14 d后对中耳鼓室进行蛋白含量检测，发现愈疡胶囊高、中剂量组TLR4、MyD88与p-NF-κB的蛋白含量均明显减少(P<0.05)，表明愈疡胶囊可通过抑制TLR4/MyD88/NF-κB对炎症与免疫产生作用，缓解肺炎链球菌造成的OM。

5 结论

愈疡胶囊能延缓肺炎链球菌所致的OM进程，主要表现在中耳鼓室黏膜细菌生物膜减少、黏膜结构修复良好、减少炎症与免疫反应等方面，其潜在治疗机制可能与抑制TLR4/MyD88/NF-κB信号通路相关。