基于核酸适配体的胶体金层析试纸条对镉离子的定量检测

＊涂东堃 郑丽婷 郑晓亮 王艺伟 曾绍校 徐晖

（福建农林大学食品科学学院 福建 350002）

引言

镉是一种人体非必须元素，进入人体后会对肺脏、肾脏等器官造成严重的损伤，且这种毒性作用时间长、不易消除，具有很强的蓄积性[1]。随着经济的发展，大量矿产开采导致重金属的平均暴露水平提高，不少地区土壤和水体中镉离子含量升高，导致农产品和食品中镉的污染，对人体健康构成威胁。因此，开发可靠的分析方法测定食品中镉离子含量对保障人们的生命健康具有重要意义。

传统的镉离子检测方法包括原子吸收光谱法[2]、原子荧光光谱法[3]、电感耦合等离子体质谱[4]、电感耦合等离子体原子发射光谱法[5]、高效液相色谱法[6]等。经过多年的发展，仪器分析法已成为成熟可靠的检测方法，具有很高的灵敏度和选择性，结果的准确性和稳定性高。而这些检测方法往往需要具备配套的大型仪器，设备耗材昂贵，这些问题限制了其在快速检测和现场检测的应用。

核酸适配体是通过指数富集的配体进化系统进化技术获得DNA或RNA，通过形成发夹、凸环和G-四聚体等结构与特定的靶标物质产生较高的亲和力，可作为金属离子、有机物或细胞等物质的分子识别元件[7]。与传统抗体相比，核酸适配体具有可人工合成和修饰，纯度高、亲和力强等特点。近些年，核酸适配体被广泛应用于金属离子的检测中。Gan等[8]设计了一种基于核酸适配体的胶体金比色传感器用于检测Cd2+，核酸适配体与Cd2+结合后，游离的核酸适配体数量减少，导致胶体金在盐的作用下聚集，溶液颜色变深。Zhu等[9]用6-羧基荧光素（6-FAM）修饰核酸适配体设计了一种荧光传感器，检测线为2.15nmol/L。重金属离子结构简单、结合位点单一，与核酸适配体结合不会发生明显的质量变化和空间位阻效应，限制了传感器的开发和应用。本研究以镉离子核酸适配体为分子识别元件，设计了一种基于竞争性反应的镉离子快速检测试纸条，以期用于食品和环境样品中镉离子的快速分析。

1.材料与方法

(1)主要材料与试剂

柠檬酸三钠、三水合氯金酸、蔗糖、吐温-20、三磷酸腺嘌呤脱氧核苷酸、十二烷基苯磺酸钠、链霉亲和素和氯化钠购于美国Sigma公司；牛血清白蛋白和HEPES缓冲溶液购于国药集团化学试剂有限公司；硝酸纤维素膜、样品垫、结合垫和底板购于上海杰一生物技术有限公司。

(2)仪器与设备

DT2032金标试纸条阅读分析仪（上海金标生物科技有限公司）；CT300裁条机（上海金标生物科技有限公司）；HM3030三维平面点膜喷仪（上海金标生物科技有限公司）；Millipore Milli-Q超纯水系统（厦门精艺兴业科技有限公司）。

(3)实验方法

①胶体金的制备

通过柠檬酸三钠盐还原氯金酸制备粒径为15～20nm的胶体金。实验中所用的玻璃器皿均用新制王水浸泡24h，用超纯水冲洗干净，烘干备用。往圆底烧瓶内加入250mL超纯水和50μL 50%氯金酸溶液，于磁力加热搅拌器上加热搅拌至沸腾。溶液沸腾后，迅速加入5mL 45mmol/L柠檬酸三钠盐，溶液的颜色由淡黄色变为灰色最后呈酒红色，继续反应10min停止加热，保持搅拌冷却至室温。收集所制得的胶体金溶液，于4℃储存。

②胶体金标记核酸复合物的制备

取6管十倍浓缩的胶体金，加入10μL 5mmol/L dATP溶液，振荡15min后加入15μL 1%的SDS溶液；加入1mol/L的NaCl溶液进行老化，于37℃水浴3h，离心取上清液，将制备所得的复合物重溶于缓冲溶液中。

③试纸条分析性能的研究

A.特异性检测

用所制备的试纸条对As3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+、Zn2+和Cd2+进行检测，对比检测结果验证试纸条的特异性。配制浓度为100ng/mL的各种金属离子溶液，取47μL金属离子溶液与3μL胶体金标记核酸适配体复合物混合，室温下振荡20min，滴加于样品垫，用50mmol/L HEPES缓冲液冲洗至样品垫上无红色。观察试纸条颜色的变化，通过试纸条的响应信号评估试纸条的特异性，每种重金属平行做3次试验。

B.重现性检测

选用0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三个浓度的Cd2+标准溶液进行分析，每个浓度做5次重复试验，计算其平均值与相对标准偏差，评估试纸条重现性能。

C.工作曲线和检测线绘制

用试纸条分别对0ng/mL、10ng/mL、30ng/mL、50ng/mL、70ng/mL、90ng/mL、100ng/mL的Cd2+标准溶液进行检测，每个浓度做3个平行样，以Cd2+浓度为横坐标，试纸条检测线响应信号为纵坐标，绘制标准曲线，计算检测限。检测限计算公式如下：

式中，a-标准曲线截距；

b-标准曲线斜率；

LOD-试纸条检测限度；

N-空白响应值的平均值。

D.信噪比的计算

以空白样溶液为对照，以100ng/mL的Cd2+标准溶液为试验组，做3次平行试验，读取检测线和控制线的峰面积，取平均值。通过空白与试验组的峰面积之差比空白组峰面积的平均值计算信噪比。信噪比计算公式如下：

式中，X1-空白样的峰面积平均值；

X2-100ng/mL样品峰面积平均值；

S/N-信噪比。

2.结果与分析

(1)镉离子核酸试纸条工作原理

当待测溶液中存在Cd2+时，胶体金标记核酸适配体（Conjugate）与Cd2+结合，形成Conjugate-Cd2+；Conjugate-Cd2+在毛细的作用下流过检测线，由于核酸适配体与Cd2+形成稳定结构，无法与捕获探针结合，检测线不显色；当样品溶液中不存在Cd2+时，核酸适配体与捕获探针1杂交互补配对，在检测线上形成红色条带。控制线显色时，为有效测试；当控制线不显色时，则视为无效测试。通过裸眼观察检测线和控制线对样品溶液进行定性分析，当检测线显示红色时样品为阴性，当检测线无色时样品为阳性；检测线上红色条带的颜色深浅与靶标Cd2+浓度成反比关系，通过检测线上的响应信号，可对样品溶液进行定量分析。

(2)特异性分析

本实验选择As3+、Cu2+、Fe3+、Mn2+、Pb2+和Zn2+做为干扰离子，分析试纸条对Cd2+离子的选择性。结果如图1所示，在相同浓度下（均为100ng/mL），试纸条对Cd2+具有最高的信噪比，显著高于其他干扰离子，说明所制备的核酸试纸条对Cd2+具有较好的选择性和特异性；尽管试纸条对干扰离子中的Cu2+、Zn2+也有微弱的信号响应，可以对Cu2+和Zn2+采取屏蔽措施以减小其对检测结果的干扰[10]。

图1 试纸条特异性检验

(3)重现性分析

重现性是试纸条性能分析的重要指标，决定着试纸条是否稳定和是否符合定量检测的要求。本实验选取0ng/mL、50ng/mL、100ng/mL三个浓度的样品进行试验，每组浓度平行测定5次。计算不同浓度下样品响应信号的平均值和相对标准偏差。结果如图2所示，经计算三种浓度下的相对标准偏差分别为4%、4%、7%，说明该试纸条具有较好的重现性。

图2 不同浓度样品的试纸条重现性检验

(4)工作曲线和检测线

在最佳条件下，对不同浓度的Cd2+进行检测，绘制试纸条工作曲线。结果如图3所示，随着Cd2+浓度逐渐增高，检测线上的颜色由深红色逐渐变浅，镉离子浓度达到100ng/mL时试纸条消线。图4为试纸条响应信号与浓度关系（工作曲线），其中横坐标为Cd2+的浓度（ng/mL），纵坐标为该浓度下的试纸条的响应信号值。计算得到工作曲线的线性方程为y=-6.6355x+706.71，R2=0.9865，检测限为3.79ng/mL，线性范围为10～100ng/mL，可利用该试纸条对一定浓度范围的镉离子进行定量检测。

图3 不同浓度镉离子样品的试纸条图片

图4 不同浓度镉离子样品的工作曲线

3.结论与讨论

本文构建了一种用于Cd2+的快速检测的胶体金标记核酸适配体试纸条。对所制备的试纸条重现性、特异性进行分析，结果表明试纸条具有较好的重现性，对Cu2+、Zn2+有较微弱的响应，其余金属离子对试纸条影响不明显。试纸条的响应信号和Cd2+浓度在10～100ng/mL时呈现良好的线性关系，线性方程为y=-6.6355x+706.71，R2=0.9865，经计算该方法检测限为3.79ng/mL。本文的试纸条检测方法与其他试纸条方法[11-13]及比色法进行对比[14-16]，本文的试纸条方法具有较低的检测限，更宽的线性范围，适合于现场的快速检测。该试纸条的灵敏度达到生活饮用水卫生标准（GB 5749-2006）中镉离子的限量5ng/mL，检测时间比国标方法缩短了1h。后续工作主要集中在继续提高检测灵敏度和稳定性：筛选更具亲和力的核酸适配体；优化试纸条的工艺；采用信号扩增技术提高灵敏度等。