HPLC法测定益脑心颗粒中10种成分及化学计量的研究

王 鑫，黄美玲，张 松，任晓东，聂振兴，陈明会*(.汉中市人民医院药剂科，汉中 7000；.汉中市铁路中心医院重症医学科，汉中 7000；.西安交通大学第一附属医院药学部，西安 7006)

益脑心颗粒由川芎、制首乌、丹参、郁金、山楂、天麻6味中药制成，具有平肝熄风、活血散瘀的作用，用于治疗血瘀肝旺所致的眩晕头痛等[1-3]。方中川芎有治疗心血管、中枢神经系统疾病等作用[4-5]；丹参中含丹酚酸B、原儿茶醛、丹参素等成分，有改善微循环、抗凝血等作用[6-7]；何首乌含有二苯乙烯苷类、没食子酸等成分，具有明显的抗衰老和保护神经等作用[8-11]；天麻含有天麻素、巴利森苷类等成分，具有保护脑、抗晕眩、镇静催眠等作用[12-15]；山楂有明显的抗氧化作用[16-19]；郁金有抗肿瘤、抗炎等作用[20-21]。

由于中药成分复杂，具有通过多靶点整体协同作用的特征，故单成分质量控制模式难以全面、科学地评价其产品质量。因此，近年来已广泛将多指标成分质量控制模式应用于中药的质量控制中[22]。现行该制剂质量标准仅对原儿茶醛进行定量控制，笔者前期曾对该制剂进行了定性研究[23]，目前无对其所含多成分进行定量研究的文献报道，为了更加全面地评价益脑心颗粒的整体质量，本实验采用高效液相色谱(high performance liquid chromatography，HPLC)法同时测定天麻素、丹参素钠、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、原儿茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B 10种成分的含量，建立益脑心颗粒多指标成分评价模式，并采用主成分分析(principal component analysis，PCA)、聚类分析(cluster analysis，CA)等化学计量学方法对定量结果进行分析，为提升益脑心颗粒的质量提供依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 NexeraXR型岛津高效液相色谱仪、SPD-M40A型二极管阵列检测器、LC/Labsoluion色谱工作站均购自日本岛津公司；KQ-100DE型台式数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；AUW220D型十万分之一电子分析天平(日本岛津公司)；Shim-pack Scepter C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)(日本岛津公司)。

1.2试药 乙腈、甲醇(色谱级，美国Honeywell公司)；水为自制超纯水；其余药品均为分析纯。天麻素(批号110807-202010，质量分数95.5%，中国食品药品检定研究院)；巴利森苷E(编号HP265839，质量分数98%),巴利森苷C(编号HP8265838，质量分数98%)，巴利森苷B(编号HP265837，质量分数98%)，巴利森苷A(编号HP265836，质量分数98%)，丹参素钠(编号HS034209，质量分数98%)，对羟基苯甲醇(编号HA062812，质量分数98%)，原儿茶醛(编号HP019896，质量分数98%)，二苯乙烯苷(编号HO118401，质量分数98%)，丹酚酸B(批号HA170502，质量分数98%)，均购自宝鸡辰光生物技术有限公司；川芎(批号200604)、制何首乌(批号200921)、丹参(批号200824)、郁金(批号200726)、山楂(批号201022)、天麻(批号201108)，均购自陕西铎耀中药饮片有限公司；益脑心颗粒(国药准字Z20025079，规格15 g×9袋/盒，批号010001～010015，编号S1～S15，陕西汉王药业股份有限公司)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱：Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相：0.1 g·L-1甲酸水溶液溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～8 min，96%～91% A；8～43 min，91%～68% A；43～70 min，68%～50% A)。记录时间：70 min；流速：0.8 mL·min-1；柱温：20℃；检测波长：220、310 nm；进样量：10 μL。

2.2混合对照品溶液的配制 分别精密称取巴利森苷A 6.64 mg、巴利森苷B 5.74 mg、巴利森苷C 10.73 mg、原儿茶醛 9.05 mg 置于50 mL量瓶中，加体积分数为50%的甲醇至刻度，摇匀，作为A溶液；另再分别精密称取对照品天麻素7.32 mg、丹参素钠12.01 mg、对羟基苯甲醇6.62 mg、巴利森苷E 7.03 mg、二苯乙烯苷6.12 mg、丹酚酸B 22.23 mg置于10 mL量瓶中，加A溶液至刻度，摇匀，即得10种成分的混合对照品溶液，作为储备液。

2.3供试品溶液的制备 取5袋益脑心颗粒内容物，研细，混匀，精密称定5 g，置于具塞锥形瓶中，加入体积分数为50%的甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率100 W，频率40 Hz)40 min，取出，放冷，再称定质量，用体积分数为50%的甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45 μm的微孔滤膜过滤，取续滤液，即为供试品溶液。

2.4阴性对照溶液的制备 按处方比例分别制成缺天麻、缺制首乌、缺丹参的模拟制剂，再依据2.3项下方法制备缺天麻、缺制首乌、缺丹参的阴性对照溶液。

2.5线性关系考察 分别精密量取储备液0.01、0.04、0.20、0.40、0.08、1.00 mL，分别置于1 mL量瓶中，加体积分数为50%的甲醇定容，混匀，即得系列混合对照品溶液，进样。以各对照品的质量浓度(μg·mL-1)为横坐标(x)、峰面积值为纵坐标(y)，绘制标准曲线，进行线性回归。线性方程、线性范围及相关系数(r)见表1。结果表明，10种对照品在相应质量浓度范围内线性关系良好。

表1 对照品的线性方程与质量浓度范围及相关系数Tab.1 Linear equations and their concentration ranges of the reference substances

2.6专属性实验 分别精密量取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各10 μL进样，记录色谱图。实验结果见图1，结果表明阴性对照无干扰，专属性强。

图1 HPLC图注：A.混合对照品；B.供试品；C.天麻阴性对照；D.制何首乌阴性对照；E.丹参阴性对照；1.天麻素；2.丹参素钠；3.对羟基苯甲醇；4.巴利森苷E；5.原儿茶醛；6.巴利森苷B；7.巴利森苷C；8.巴利森苷A；9.二苯乙烯苷；10.丹酚酸B。Fig.1 HPLC chromatogramsNotes：A.mixed reference substance；B.sample；C.sample without Gastrodiae Rhizoma；D.sample without Polygoni multiflori radix Praeparata；E.sample without Salviae miltiorrhizae radix Et Rhizoma；1.gastrodin;2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol;4.palisenoside E;5.protocatechuic aldehyde;6.palisenoside B；7.palisenoside C；8.palisenoside A；9.stilbene glycoside；10.salvianolic acid B.

2.7精密度实验 精密吸取供试品溶液(批号010001)，重复进样5次，计算得天麻素、丹参素钠、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、原儿茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B峰面积的RSD值分别为0.99%、0.95%、1.09%、1.04%、0.97%、0.91%、0.97%、0.91%、0.92%、0.85%，表明仪器的精密度良好。

2.8稳定性实验 精密吸取供试品溶液(批号010001)，在0、2、4、8、12、24 h进样。计算得天麻素、丹参素钠、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、原儿茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B峰面积的RSD值分别为0.94%、0.91%、1.17%、1.12%、1.06%、1.21%、1.09%、1.03%、1.08%、1.11%，表明该溶液在24 h内稳定。

2.9重复性实验 精密称取样品(批号010001)6份，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件测定，计算天麻素、丹参素钠、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、原儿茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的平均含量与RSD值，结果见表2，表明该方法重复性良好。

表2 重复性实验结果Tab.2 Results of repeatability test

2.10加样回收率实验 精密称定益脑心颗粒(批号010001)内容物7.5 g，置于具塞锥形瓶中，添加混合对照品溶液10 mL(分别精密称取对照品：天麻素20.52 mg、丹参素钠100.00 mg、对羟基苯甲醇8.16 mg、巴利森苷E 9.18 mg、原儿茶醛11.22 mg、巴利森苷B 2.55 mg、巴利森苷C 16.33 mg、巴利森苷A 7.14 mg、二苯乙烯苷61.22 mg、丹酚酸B 418.37 mg置于100 mL量瓶中加体积分数为50%的甲醇至刻度，摇匀，得混合对照品溶液，质量浓度依次为0.196、0.980、0.080、0.090、0.110、0.025、0.160、0.070、0.600、4.100 mg·mL-1)，再按照2.3项下方法制备供试品溶液，按照2.1项下色谱条件测定，重复制样6份，结果见表3，表明该方法回收率良好。

表3 加样回收率实验结果Tab.3 Test results of sample recovery

2.11含量测定 精密称取15批样品，分别按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下条件测定。天麻素、丹参素钠、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、原儿茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的含量测定结果见图1与表4。

表4 15批益脑心颗粒中10种成分的含量测定结果Tab.4 The results of determination of 10 components in 15 batches of Yinaoxin Granules

2.12色谱条件及制样方法筛选结果 对以下项目进行比较：不同品牌的色谱柱，如Shim-pack Scepter C18、Phenomenex/Luna C18、Kromasil C18等，不同规格，如(150 mm×4.6 mm，5 μm)、(250 mm×4.6 mm，5 μm)、(100 mm×4.6 mm，5 μm)等；不同流动相系统，如甲醇-甲酸水溶液(0.05、0.1、0.15 g·L-1)、乙腈-甲酸水溶液(0、0.05、0.1、0.15 g·L-1)、 乙腈-醋酸水溶液(0.2、0.5、1.0 g·L-1)等；不同柱温(20、25、30 ℃)；不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)；不同溶剂(甲醇、水、不同体积分数的甲醇、不同体积分数的乙醇)；提取方法(超声及超声时间、加热回流)等。最终选择色谱柱为Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相系统为0.1 g·L-1甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脱；流速为0.8 mL·min-1；柱温为20 ℃；选择体积分数为50%的乙醇超声。见2.1项、2.3项及图2～图5。

图2 不同品牌色谱柱HPLC图Fig.2 HPLC chromatograms of different brands of chromatographic columns注：A.检测波长为220 nm；B.检测波长为310 nm；a、d.Shim-pack Scepter C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；b、e.Phenomenex/Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；c、f.Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)。1.天麻素；2.丹参素钠；3.对羟基苯甲醇；4.巴利森苷E；5.原儿茶醛；6.巴利森苷B；7.巴利森苷C；8.巴利森苷A；9.二苯乙烯苷；10.丹酚酸B。Notes：A.the detection wavelength was 220 nm；B.the detection wavelength was 310 nm；a，d.Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；b，e.Phenomenex/Luna C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)；c，f.Kromasil C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm).1.gastrodin；2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol；4.palisenoside E；5.protocatechuic aldehyde；6.palisenoside B；7.palisenoside C；8.palisenoside A；9.stilbene glycoside；10.salvianolic acid B.

图3 不同规格色谱柱HPLC图(220 nm)注：A.250 mm×4.6 mm，5 μm；B.150 mm×4.6 mm，5 μm；C.100 mm×4.6 mm，5 μm；1.天麻素；2.丹参素钠；3.对羟基苯甲醇；4.巴利森苷E；5.原儿茶醛；6.巴利森苷B；7.巴利森苷C；8.巴利森苷A；9.二苯乙烯苷；10.丹酚酸B。Fig.3 HPLC chromatograms of different specifications of chromatographic columns (220 nm)Notes：A.250 mm×4.6 mm，5 μm；B.150 mm×4.6 mm，5 μm；C.100 mm×4.6 mm，5 μm；1.gastrodin；2.danshensu sodium;3.p-hydroxybenzyl alcohol；4.palisenoside E；5.protocatechuic aldehyde；6.palisenoside B；7.palisenoside C；8.palisenoside A；9.stilbene glycoside；10.salvianolic acid B.

图4 不同流动相与不同柱温HPLC图(220 nm)

图5 不同流速、样品不同处理方法与不同超声时间HPLC图注：A.不同流速；B.样品不同处理方法；C.不同超声时间；s1.流速为0.6 mL·min-1；s2.流速为0.8 mL·min-1；s3.流速为1.0 mL·min-1；s4.流速为1.2 mL·min-1；t1.样品处理溶剂为甲醇超声40 min；t2.样品处理溶剂为水超声40 min；t3.样品处理溶剂为体积分数50%甲醇，超声40 min；t4.样品处理溶剂为体积分数50%乙醇，加热回流40 min；u1.样品处理溶剂为体积分数50%乙醇，加热回流30 min；u2.样品处理溶剂为体积分数50%乙醇，超声60 min。Fig.5 HPLC chromatograms of different flow rates，different sample treatment methods and different ultrasonic timesNotes：A.different flow rates；B.different treatment methods of samples；C.different ultrasonic time；s1.the flow rate was 0.6 mL·min-1；s2.the flow rate was 0.8 mL·min-1；s3.the flow rate was 1.0 mL·min-1；s4.the flow rate was 1.2 mL·min-1；t1.the sample treatment solvent was methanol，ultrasonic for 40 min;t2.the sample treatment solvent was water ultrasonic for 40 min；t3.the sample treatment solvent was 50% methanol，ultrasonic for 40 min；t4.the sample treatment solvent was 50% ethanol，heated and refluxed for 40 min；u1.sample treatment solvent was 50% ethanol，heated and refluxed for 30 min；u2.sample was treated with 50% ethanol for 60 min.

2.13化学计量研究

2.13.1聚类分析 运用SPSS 26.0软件，以15批益脑心颗粒中10种活性成分的含量为数据样本，采用组间联接法，以欧氏距离为测度[24-25]，进行系统CA，结果见图6。依据聚类分析树状图，当类间距离为6时，15批样品可聚为4类，S3、S13、S8、S6、S5、S15、S7、S9、S10为第Ⅰ类，S1、S11为第Ⅱ类，S2、S12为第Ⅲ类，S4、S14为第Ⅳ类；当类间距离为10时，15批样品可聚为3类，上述第Ⅰ、Ⅱ类聚为一类，第Ⅲ类聚为一类；第Ⅳ类聚为一类。当类间距离为15时，15批样品可聚为2类，上述第Ⅰ、Ⅱ类聚为一类，第Ⅲ、Ⅳ类聚为一类；第Ⅳ类聚为一类。

图6 15批益脑心颗粒聚类分析树状图Fig.6 CA tree diagram of 15 batches of Yinaoxin Granules

2.13.2主成分分析 将15批益脑心颗粒中10种成分的含量导入统计软件SPSS 26.0 中，进行PCA，计算相关系数的特征值和方差贡献率[24-25]，提取出4种主成分，结果见图7和表5。由表5可知，前4种主成分特征值大于1，即3.244、2.518、1.757、1.270，对方差的贡献率分别为32.439%、25.176%、17.568%、12.698%，累计方差贡献率为87.881%，大于85%，表明提取前4种主成分即可代表益脑心颗粒10种共有成分87.881%的信息，可以被用于评价益脑心颗粒的质量。

图7 样品PCA碎石图Fig.7 PCA scree plot of various samples

表5 主成分方差分析Tab.5 Analysis of variance for PCA

以y1、y2、y3、y4表示表6种4种主成分1、2、3、4作为15批次益脑心颗粒所含10种成分的信息并建立线性方程。

表6 初始因子载荷矩阵Tab.6 Initial factor load matrix

y1=0.531x1+0.483x2-0.46x3-0.453x4+0.167x5-0.021x6+0.121x7+0.087x8+0.079x9-0.056x10；y2=0.023x1+0.127x2-0.025x3+282x4+0.553x5+0.461x6-0.387x7+0.175x8-0.331x9-0.309x10；y3=-0.001x1+0.129x2+0.234x3+0.033x4-0.177x5+0.269x6-0.073x7+0.684x8+0.592x9-0.006x10；y4=-0.023x1-0.32x2-0.339x3-0.138x4+0.121x5+0.339x6-0.258x7+0.005x8+0.062x9+0.75x10。式中各变量为标准化变量。将线性方程与所对应主成分的方差贡献率相乘后再除以累计贡献率可计算综合得分，计算综合得分的方程为y=(32.439y1+25.176y2+17.568y3+12.698y4)/87.881。根据此方程计算得出的综合得分与排序见表7。综合得分越高，表明该批次样品的质量越好。由表7可见，010010批次的质量最优，其次是010009批次和010006批次，排在最后是010001批次和010011批次。

表7 15批益脑心颗粒的综合得分Tab.7 Comprehensive score of 15 samples Yinaoxin Granules

3 分析与讨论

3.1检测方法的选择 使用二极管阵列检测器对益脑心颗粒样品进行全波长扫描，结果显示各成分的最大吸收波长：天麻素为220、270 nm，丹参素钠为199、301 nm，对羟基苯甲醇为223、274 nm，原儿茶醛为277、312 nm，巴森利甘A、B、C、E均为220、270 nm，二苯乙烯苷为235、310 nm，丹酚酸B为288、309 nm。因此，将220 nm作为天麻素、对羟基苯甲醇及巴森利甘A、B、C、E的检测波长，将310 nm作为丹参素钠、原儿茶醛、二苯乙烯苷、丹酚酸B的检测波长。采用梯度洗脱，选择不同品牌的色谱柱，如Shim-pack Scepter C18、Phenomenex/Luna C18、Kromasil C18等进行比较，选择不同规格的色谱柱，如(150 mm×4.6 mm，5 μm)，(250 mm×4.6 mm，5 μm)、(100 mm×4.6 mm，5 μm)等进行比较，选择不同流动相系统，如甲醇-甲酸水溶液(0.05、0.1、0.15 g·L-1)，乙腈-甲酸水溶液(0、0.05、0.1、0.15 g·L-1)，乙腈-醋酸水溶液(0.2、0.5、1.0 g·L-1)等，选择不同柱温(20、25、30 ℃)，不同流速(0.6、0.8、1.0、1.2 mL·min-1)进行比较。最终确定检测色谱条件：色谱柱Shim-pack Scepter C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相系统乙腈-0.1 g·L-1甲酸水溶液；柱温20 ℃；流速0.8 mL·min-1，在该条件下目标峰分离度良好。因为天麻含有天麻素、对羟基苯甲醇及巴森利甘A、B、C、E等成分，所以制备阴性对照时需要剔除天麻；二苯乙烯苷仅在制首乌中存在，制备阴性对照时需要去除制首乌；丹参中含有丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B，故制备阴性对照时需要去除丹参。益脑心颗粒中天麻为生药粉入药，对溶剂(甲醇、水、不同体积分数的甲醇、不同体积分数的乙醇)及提取方法(超声及超声时间、加热回流)等进行比较，结果选择体积分数为50%的乙醇超声40 min提取，得到较理想的目标峰信息。

3.2化学计量学研究 CA结果显示聚类为两大类，不同批次益脑心颗粒中10种成分的含量差异可能与益脑心颗粒生产所用原药材的种属来源、产地、采收季节、生长年限、加工炮制方式等因素有关。PCA结果显示前4种主成分特征值大于1(分别为3.244、2.518、1.757、1.270)，对方差的贡献率分别为32.439%、25.176%、17.568%、12.698%，累计方差贡献率达87.881%，大于85%，表明提取前4种主成分即可代表益脑心颗粒10种共有成分87.881%的信息；综合得分表明，编号为010010、010009和010006的样品质量较好。因此，2项分析可以用于评价益脑心颗粒的质量。

总之，本实验采用HPLC 梯度洗脱法测定了益脑心颗粒中天麻素、丹参素钠、对羟基苯甲醇、巴利森苷E、原儿茶醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A、二苯乙烯苷、丹酚酸B的含量，该方法操作简单，易于实施，准确性、稳定性、重复性好，专属性强，并对含量测定结果进行了PCA和CA，提示药品生产企业应加强对原药材源头的质量控制和对药品生产过程参数的优化。本研究亦为全面提升该产品的质量，保证该药品质量与临床疗效的一致性提供科学依据。