BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌组织中的表达及与病理参数、预后的关系研究

宋 丹，王艳艳，张 杰，赵云清

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。胃癌不仅会造成消化系统损害，而且可能发生转移，影响患者的肝肾及呼吸功能，甚至出现恶病质，最终危及其生命[1]。早期胃癌预后较好，但其早期病情隐匿，故寻找有效的分子标记物评价胃癌患者预后有重要意义。

脑选择性蛋白激酶2(brain-selective kinase 2, BRSK2)是腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase/AMPK)家族的一员，早期认为其主要功能是维持神经系统稳定。随着研究的不断深入，发现BRSK2可通过调节细胞周期影响细胞增殖和凋亡，并且在多种消化道肿瘤的发生和发展过程中发挥重要作用[2]。X染色体连锁锌指蛋白(zinc finger protein X-linked, ZFX)位于X染色体，属于锌指蛋白家族，在多种肝细胞的自我更新和抗凋亡机制中发挥重要作用。近年来大量研究发现ZFX在恶性肿瘤患者中呈高表达状态，然而其表达与胃癌患者各项临床指标及预后的关系尚不明确[3]。胶原三股螺旋重复蛋白1(collagen triple helix repeat containing 1, CTHRC1)是一种新发现的具有生物活性的基因产物，属于分泌型蛋白。多项研究显示，在肿瘤组织中CTHRC1可参与多种机制调节信号通路及肿瘤的形成、侵袭与转移[4]。本研究分析了BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌组织中的表达及与其病理参数、预后的关系。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2016年1月—2018年1月本院收治的58例胃癌患者的临床资料。①纳入标准：所有患者有明确的病理学诊断依据确诊为胃癌；入组前未接受过放疗及化疗；临床资料完整且真实。②排除标准：合并血液疾病者；无法耐受本研究检测方法者；严重精神疾患或痴呆等无法配合本研究者；存在除胃癌以外其他原发恶性肿瘤者；合并风湿免疫及结缔组织病变者。男25例，女33例；年龄28～80(53.21±6.37)岁；根据病理部位不同分为胃癌组织组(肿瘤组织)和癌旁组织组(距离胃癌组织5 cm以的上正常胃黏膜组织)，每组58例。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。

1.2研究方法 收集纳入者的临床资料，比较BRSK2、ZFX及CTHRC蛋白在胃癌及癌旁组织的表达情况；记录纳入者在随访时间内存活及死亡情况，分析BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白与胃癌患者各病理参数的相关性，绘制Kaplan-Meier生存曲线研究BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白对患者预后的影响，并采用多元Logistic回归分析影响胃癌患者预后生存的危险因素。

1.3观察指标及方法

1.3.1主要试剂与仪器：RNA提取试剂盒、反转录合成试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，引物购自上海生工生物公司，兔抗人BRSK2多克隆抗体，购自北京博奥森生物技术有限公司，ZFX单克隆抗体购自美国Abcam公司，即用型免疫组织化学UltraSensitive TM S-P超敏试剂盒(鼠/兔)购自福州迈新技术开发有限公司，DAB 显色试剂盒购置北京中杉金桥生物技术有限公司。实时荧光定量PCR仪为illumina Ero，光学显微镜为日本 OLYMPUS。

1.3.2BRSK2的表达水平检测：将所收集的组织制作成厚度4 μm的切片，放入80℃烤箱中烤片30 min后经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；切片经柠檬酸缓冲液煮沸法修复抗原，冷却后用PBS缓冲液冲洗；然后用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性；切片滴加兔抗人BRSK2多克隆抗体(一抗)，在4℃下孵育过夜；PBS缓冲液冲洗切片后滴加通用型IgG抗体-HPR多聚体，37℃下孵育15 min；PBS缓冲液冲洗后采用现配DAB试剂染色，苏木精轻度复染细胞核冲洗脱水干燥后用中性树胶封片，PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。

1.3.3ZFX的表达水平检测：切片处理、脱蜡、梯度乙醇水化、抗原修复(同BRSK2的表达水平检测)后，滴加ZFX一抗，4℃孵育过夜。次日PBS缓冲液洗涤后，滴加二抗，37℃孵育30 min。最后DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。ZFX 阳性切片可见细胞核呈棕黄色，部分病例可见胞质着色。

1.3.4CTHRC1的表达水平检测：将所收集的组织制作成厚度4 μm的切片，放入60℃烤箱中烤片30 min后经二甲苯脱蜡和梯度乙醇水化；使用PH 6.0的柠檬酸抗原修复液修复抗原，冷却后用PBS缓冲液冲洗；然后用3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性；稀释兔抗人 CTHRC1多克隆抗体，之后在载玻片加入稀释好的CTHRC1抗体并孵育，放入4℃冰箱中过夜。于次日滴加二抗，37℃下孵育20 min。最后DAB显色，苏木精复染，中性树胶封片。

1.3.5结果判定[5]：每张组织切片在高倍镜视野下随机选择5个视野，依据切片中细胞染色强度和阳性细胞染色范围判定染色结果显微镜下双盲法阅片，染色范围1%～5%计为0分，6%～25%计为1分，26%～50%计为2分，51%～75%计为3分，76%～100%计为4分。染色强度评分：0分为基本不着色，1分为浅黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色；两者相乘最终得分：0分为阴性，1～2分为弱表达，3～4分为中度表达，5～6分为强表达，>2分均认定为阳性表达。

1.4随访 所有纳入者均从术后开始随访，直至死亡或随访结束日期，为期2年，截止于2019年12月。患者的随访时间分布在2～24(16.71±5.93)个月。随访主要采用电话、微信随访及患者来院复查为主。在本研究总生存时间(Overall Survival, OS)表示胃癌患者从手术至死亡的时间[6]。

2 结果

2.1BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌及癌旁组织的表达 BRSK2在胃癌组织中的阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05)，ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织(P<0.01)。见表1。

表1 2组BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌及癌旁组织的表达情况比较[例(%)]

2.2BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表达情况与胃癌各病理参数的相关性 BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表达情况与胃癌患者的年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤直径、手术方式及组织分化程度无关(P>0.05)；与侵袭深度、淋巴结转移及TNM分期相关(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表达情况与胃癌患者各病理参数的相关性(例)

2.358例胃癌预后情况 截至随访结束，58例胃癌死亡17例，存活41例，病死率为29.31%，存活率为70.69%。

2.4BRSK2表达与胃癌预后生存的关系 BRSK2阴性组的平均生存时间为18.61个月，BRSK2阳性组的平均生存时间为29.83个月；BRSK2阴性组平均生存时间短于BRSK2阳性组(P<0.05)。见图1。

图1 不同BRSK2表达胃癌患者的生存情况比较

2.5ZFX表达与胃癌预后生存的关系 ZFX阴性组的平均生存时间为30.78个月，ZFX阳性组平均生存时间为15.57个月，ZFX阴性组平均生存时间长于ZFX阳性组(P<0.05)。见图2。

图2 不同ZFX表达胃癌患者的生存情况比较

2.6CTHRC1蛋白表达与胃癌预后生存的关系 CTHRC1蛋白阴性组的平均生存时间35.00个月，CTHRC1蛋白阳性组平均生存时间为15.07个月，CTHRC1蛋白阴性组平均生存时间长于CTHRC1蛋白阳性组(P<0.05)。见图3。

图3 不同CTHRC1蛋白表达胃癌患者的生存情况比较

2.7影响胃癌预后生存的单因素和多因素分析 侵袭深度为T3+T4、存在淋巴结转移、BRSK2阴性、ZFX阳性、CTHRC1蛋白阳性为影响胃癌预后生存的独立危险因素(P<0.05)。见表3。

表3 影响胃癌患者预后生存的单因素和多因素分析

3 讨论

胃癌恶性程度高，早期症状不明显且进展迅速，单纯地依靠临床和病理分期对患者预后进行评估缺乏准确性和特异性[7]。因此寻求与肿瘤生长及发展有关的分子标志物，对于肿瘤疾病的初步筛查、诊断、治疗和预后判断尤为重要。

3.1BRSK2在胃癌组织中表达水平及其与临床病理学参数的关系 近年来，蛋白激酶AMPK及其家族成员与肿瘤的关系逐渐引起关注。由于肿瘤细胞常处于过度增殖状态，其周围血液及营养供应有限，导致肿瘤周围微环境缺血、缺氧及低糖[8]。而作为APMK家族的重要组成部分，BRSK2能够参与内质网应激诱导的细胞凋亡，可以增强癌细胞抵抗糖饥饿环境的能力[9]。

Saiyin等[10]利用iRNA技术将培养液中的BRSK2活性抑制后，发现肿瘤细胞出现大片坏死，这一发现说明BRSK2可增强肿瘤细胞在缺乏能量环境中的侵袭性。本研究对58例胃癌组织进行检测，结果显示BRSK2蛋白主要在细胞质中表达，其在胃癌组织中的阳性表达率低于癌旁组织，提示BRSK2蛋白表达水平降低可反映机体癌变的发生。利用Kaplan-Meier曲线对不同BRSK2蛋白表达情况预后生存情况进行对比分析，发现BRSK2阴性组平均生存时间短于阳性组，这与王小强等[11]研究结果相似，进一步说明BRSK2的表达水平下降是影响患者死亡的高危因素之一。

本研究结果显示，BRSK2蛋白在胃癌组织中的表达水平与肿瘤侵袭深度、TNM分期及淋巴结转移相关。本研究结果同时显示，侵袭深度为T3+T4、存在淋巴结转移为影响胃癌患者预后生存的独立危险因素，表明BRSK2蛋白可能与肿瘤进展及不良预后相关，提示其可作为胃癌患者一个潜在的预后分子生物学标志物。

3.2ZFX在胃癌组织中表达水平及与患者临床病理学参数的关系 锌指蛋白在机体发育和分化过程中发挥着重要的生理功能，胃锌指蛋白存在于胃壁细胞中，可调节分泌胃酸的胃壁细胞中H+/K+-ATP酶，进而调节胃功能[12]。ZFX是一种由X染色体编码的锌指蛋白转录因子，属于典型的C2H2型蛋白。2018年张雪等[13]通过研究发现ZFX的表达降低后与肝内胆管癌细胞的克隆形成、增殖、迁移、转移能力相关，推测ZFX在肝内胆管癌的发生发展中发挥重要的作用。本研究结果亦显示，ZFX在胃癌组织组阳性表达率高于癌旁组织组，提示ZFX在胃癌的发生发展中发挥着促癌基因的作用。

本研究结果显示，ZFX蛋白在胃癌组织中的表达水平与患者肿瘤侵袭深度、TNM分期及淋巴结转移相关，提示ZFX异常表达增高与胃癌的恶性程度、疾病的进展及转移均密切相关。分析其原因可能与ZFX通过修改下游某些基因的表达，如胱天蛋白1等，来调节肿瘤细胞的增殖与凋亡。进一步的Kaplan-Meier生存分析显示，ZFX阴性组平均生存时间长于阳性组，这与崔记芳等[14]研究结果相似，提示ZFX可作为评价胃癌患者预后的潜在分子标志物之一。

3.3CTHRC1在胃癌组织中表达水平及与患者临床病理学参数的关 CTHRC1基因定位于人类染色体8q22.3上，而CTHRC1蛋白只在特定组织的细胞外复合物中表达，同细胞外复合物相关，并带有一个短小的超二级胶原蛋白结构。唐振宁等[15]发现CTHRC1蛋白在甲状腺乳头状癌组织中的表达异常增强，推测CTHRC1与甲状腺乳头状癌的发生与发展相关，可能参与了甲状腺乳头状癌上皮-间质转化过程。2019年汤月良等[16]通过采用Western blotting检测胃癌组织、癌旁组织和胃癌细胞CTHRC1的蛋白表达水平，并采用Kaplan-Meier分析CTHRC1蛋白在胃癌组织中的表达情况与胃癌患者预后的关系，发现CTHRC1蛋白在胃癌组织中的阳性表达率高于癌旁组织，胃癌组织中CTHRC1高表达患者的5年生存率明显低于低表达患者；本研究与其结果一致。说明CTHRC1蛋白在高表达状态下可促进胃癌细胞的增殖，分析其原因可能与CTHRC1通过改变肿瘤微环境，影响肿瘤细胞的生存环境，最终促进肿瘤的转移和发展有关[17]。

本研究分析了CTHRC1蛋白与胃癌各临床病理参数之间的关系，结果显示CTHRC1蛋白在胃癌组织中的表达水平与患者肿瘤侵袭深度、TNM分期及淋巴结转移相关，提示CTHRC1蛋白阳性表达参与了胃癌的发生、侵袭和转移。一般来说，肿瘤患者的预后与分化程度相关；在其他条件同等的前提下，分化程度低的患者较病理分级低的患者生存期短[18-20]。而TNM分期在评估预后方面有着重要的作用，胃癌患者的生存期随着TNM分期升高而缩短，本研究结果亦显示，侵袭深度为T3+T4、存在淋巴结转移是影响胃癌患者预后生存的独立危险因素，也进一步证实CTHRC1蛋白表达情况与胃癌的发展关系密切，可将其作为预测胃癌预后的分子标志物之一。

本研究不足之处为纳入样本量较少，导致抽样误差，结果不具有代表性；随访方式以电话随访等为主，缺乏临床验证，不能确定患者死亡是否均与胃癌有关。为进一步分析BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌组织中的表达及与病理参数、预后的关系，未来可扩大样本量，加强随访真实性。

综上所述，BRSK2在胃癌组织中表达水平下降，ZFX及CTHRC1蛋白在胃癌组织中的表达水平增高；BRSK2、ZFX及CTHRC1蛋白表达异常均参与了胃癌的发生和发展，与预后生存关系密切，可作为预测胃癌预后的分子标志物和治疗的潜在靶点。