膀胱癌组织中LncRNA DDX11-AS1与LAMB3表达及临床意义

吴 芳，王 璨，谭 智，张雨相，易小明

膀胱癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤，全球范围内，每年发病例数达43万，占据所有恶性肿瘤的第11位，年龄标化病死率达4.6/100 000[1]。膀胱癌的临床治疗方式包括手术治疗、化疗、放射治疗及生物治疗等；但因膀胱癌肿瘤的异质性较大，复发率高，对于肌层浸润性膀胱癌更易出现局部浸润及远处转移，此类患者远期生存预后不佳[2]。因而有必要深入研究其分子机制，寻找新的诊断治疗靶点。长链非编码RNA(long-noncoding RNA, LncRNA)DDX11-AS1，位于12p11.21，又称为内聚调节剂非编码RNA，在胃癌、肝癌及乳腺癌等肿瘤中均存在异常表达的现象[3-4]。研究发现，LncRNA DDX11-AS1广泛参与真核生物多种细胞中基因转录激活，通过促进下游如紧密连接蛋白7基因的表达，促进肿瘤细胞的增殖转移及化疗耐药性的产生[5]。层黏连蛋白亚基α3(laminin subunit alpha 3, LAMα3)基因位于1q32.2，该基因编码产物属于基底膜蛋白家族。LAMB3蛋白是层黏连蛋白β亚基，与α和γ亚基一起形成层黏连蛋白5。LAMB3广泛参与许多生物过程，如细胞黏附、迁移及与其他细胞外基质成分的相互作用。研究表明，LAMB3在甲状腺癌、甲状腺乳头状癌、肝细胞癌和胰腺癌的发生和发展中起着重要作用[6-7]。但LAMB3在膀胱癌中的潜在调控机制及临床意义尚不清楚。本研究通过免疫组化方法检测了膀胱癌的癌组织中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA和蛋白表达水平，初步探讨两者的表达与临床病理特征的关系及临床意义。

1 资料与方法

1.1临床资料 回顾性分析2015年2月—2016年2月我院诊治并行手术治疗的84例膀胱癌患者的临床病理资料。①纳入标准：初次发现；病理学检查确诊为膀胱移行细胞癌；无其他肿瘤病史；既往无手术、放化疗等肿瘤治疗史；所有患者对本研究知情同意并签字。②排除标准：合并间质性膀胱炎、膀胱炎等疾病；伴有严重心肺等脏器功能障碍；合并自身免疫系统疾病或精神障碍性疾病。男51例，女33例；年龄31～77(48.3±7.2)岁；病理分级：高分化35例，中低分化49例；肿瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期54例，Ⅲ～Ⅳ期30例；肌层浸润48例，非肌层浸润36例；肿瘤直径≤3 cm者44例，直径>3cm者40例；伴淋巴结转移29例，无淋巴结转移55例。本研究经我院伦理委员会审核批准通过。

1.2膀胱癌组织中LAMB3蛋白表达 采用免疫组织化学法检测，将组织用10%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，切片70℃、烤片2 h；二甲苯脱蜡2遍，梯度水化；高压锅法抗原热修复：3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶；5%羊血清，室温封闭30 min；滴加足够量的稀释好的一抗(LAMB3稀释比1∶500)，4℃孵育过夜，LAMB3抗体购自Abcam公司，货号ab97765。二抗室温孵育2 h；DAB显色5 min；苏木精复染1 min，盐酸乙醇分化；梯度脱水，封片镜检。染色结果判定：根据阳性表达部位的染色强度及细胞数对蛋白表达进行评估。胞质不着色为0分，颜色浅为1分，棕黄色颗粒为2分，颜色深为3分。无染色细胞为0分，阳性细胞数<25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分。结果以染色强度评分与阳性细胞数评分的乘积计算，0～2分判定为阴性，3～9分判定为阳性。

1.3随访 所有纳入者自出院起开始随访，采用电话方式或者门诊随访方式进行，随访内容为患者生存情况，每月随访1次，总随访时间5年。计算5年总体生存率(overall survival, OS)。随访截止日期为随访时间结束或患者出现死亡。

2 结果

2.1LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表达比较 膀胱癌癌组织中LncRNA DDX11-AS1的相对表达量为0.685±0.114，癌旁组织为0.121±0.022。癌组织中LncRNA DDX11-AS1的相对表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。膀胱癌癌组织中LAMB3 mRNA的相对表达量为0.835±0.121，癌旁组织为0.220±0.053，癌组织中LAMB3 mRNA的相对表达量显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。

图1 膀胱癌患者癌组织和癌旁组织中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表达情况比较

2.2癌组织与癌旁组织中LAMB3蛋白表达比较 LAMB3棕黄色阳性表达主要位于细胞质，少量表达于细胞膜。癌组织与癌旁组织中LAMB3蛋白表达阳性表达率分别为72.619%(61/84)、17.857%(15/84)。癌组织中LAMB3蛋白表达的阳性率显著高于癌旁组织，差异有统计学意义(P<0.01)。见图2。

图2 膀胱癌患者癌组织及癌旁组织中LAMB3蛋白表达情况(SP×400)

2.3癌组织中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3表达与临床病理特征的关系 膀胱癌癌组织中LncRNA DDX11-AS1与LAMB3表达与肿瘤TNM分期、是否合并淋巴结转移有关(P<0.05)，与患者性别、年龄、肿瘤大小、浸润深度及病理分级无关(P>0.05)。TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴结转移的膀胱癌患者癌组织中LncRNA DDX11-AS1及LAMB3 mRNA表达高于TNM分期I～Ⅱ期、无淋巴结转移癌组织的膀胱癌患者(P<0.05)。见表1。

表1 膀胱癌患者癌组织中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表达与临床病理特征的关系

2.4癌组织中LncRNA DDX11-AS1与LAMB3表达的相关性 膀胱癌患者癌组织中 LncRNA DDX11-AS1表达与LAMB3表达呈显著正相关(r=0.564，P<0.01)。见图3。

2.5不同LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表达患者生存预后比较 84例膀胱癌患者的5年OS为65.476%(55/84)。LncRNA DDX11-AS1高表达组44例，5年OS为54.545%(24/44)；LncRNA DDX11-AS1低表达组40例，5年OS为77.50%(31/40)。与LncRNA DDX11-AS1低表达组相比，LncRNA DDX11-AS1高表达组预后差(P<0.05)。LAMB3高表达组41例，5年OS为46.341%(19/41)；LAMB3低表达组43例，5年OS为83.721%(36/43)。LAMB3高表达组预后较LAMB3低性表达组预后差(P<0.05)。见图4。

图4 不同LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表达的膀胱癌患者生存预后比较

3 讨论

我国膀胱癌的发病率为7.49/100 000，约占我国恶性肿瘤发病构成2.50%；多数患者确诊时已为中晚期，虽然给予积极手术、化疗等综合治疗，但仍有部分膀胱癌患者术后出现肿瘤复发或进展，影响其长期生存[8]。因此，研究膀胱癌的发病机制并寻找新的诊断治疗靶点具有重要临床意义。非编码RNA是一类无蛋白质编码功能的RNA调控分子。可分为微小RNA、lncRNA及环状RNA等。以往认为非编码RNA是细胞内转录过程中的“垃圾”，但目前大量研究表明非编码RNA在细胞分化发育、代谢及衰老等过程中均发挥重要的调控作用[9]。

LncRNA DDX11-AS1是近年来研究发现的参与真核生物中多种细胞中基因转录激活的非编码RNA分子。研究表明，肿瘤中LncRNA DDX11-AS1能够通过表观遗传学修饰影响癌基因的转录，促进肿瘤细胞的无限增殖、代谢重编程及转移等行为，检测肿瘤中LncRNA DDX11-AS1的表达有利于判断患者预后生存时间[10]。本研究结果显示，癌组织中LncRNA DDX11-AS1的表达上调；其表达上调的机制尚不清楚，可能与肿瘤发生时转录调控异常有关。研究表明，肿瘤中促进LncRNA DDX11-AS1表达的转录因子YY1表达升高，其能结合到启动子区，促进LncRNA DDX11-AS1的表达[5]。本研究结果显示，膀胱癌癌组织中LncRNA DDX11-AS1的表达与肿瘤TNM分期、是否合并淋巴结转移有关，肿瘤分期越高、伴有淋巴结转移的患者癌组织中LncRNA DDX11-AS1表达水平较高。表明LncRNA DDX11-AS1的表达能促进膀胱癌的发生发展；分析其原因可能为LncRNA DDX11-AS1作为分子海绵，结合并抑制微小RNA326等，进而导致AKT信号通路的过度激活，AKT促进癌基因如血管内皮生长因子、血小板源生长因子受体等表达，促进肿瘤细胞的增殖及淋巴结转移[3，11]。有学者通过大规模RNA测序分析发现，肝癌中LncRNA DDX11-AS1异常表达，与患者不良预后密切相关[12]。本研究通过分析LncRNA DDX11-AS1表达与患者生存预后的关系，发现高表达LncRNA DDX11-AS1的膀胱癌患者5年OS较低，表明膀胱癌组织中LncRNA DDX11-AS1的表达促进膀胱癌的进展，检测癌组织中LncRNA DDX11-AS1的表达有可能成为判断预后的标志物，并可能成为新的治疗靶点。

LAMB3是层黏连蛋白家族的成员，是基底层的重要的生物活性成分，具有调控细胞的分化、迁移、黏附、增殖和存活等生物学功能。研究表明，LAMB3参与促进多种恶性肿瘤的进展，影响宫颈癌、头颈部鳞癌等恶性肿瘤的侵袭和转移能力[13-14]。本研究结果显示，膀胱癌癌组织中LAMB3 mRNA的相对表达量及蛋白的阳性表达率均明显高于癌旁组织组，表明癌组织中LAMB3表达上调。其机制可能是LAMB3的转录后调控异常有关。研究表明，微小RNA-24-3p能够结合于LAMB3 mRNA的3'非编码区，降低LAMB3 mRNA的稳定性。而肿瘤发生时微小RNA-24-3p表达下调，导致LAMB3表达增加[15]。本研究亦表明，肿瘤分期Ⅲ～Ⅳ期及伴淋巴结转移患者的癌组织LAMB3表达明显较高，提示LAMB3促进膀胱癌的发生发展。研究表明，LAMB3表达上调能够促进肿瘤细胞中上皮间质转化相关转录因子Slug等的表达，促进间质性表型如波形蛋白等的表达，而上皮性表型如E钙黏素表达下调，肿瘤细胞的侵袭能力增强，促进肿瘤细胞的浸润及转移，导致肿瘤分期升高[16-17]。此外，高表达LAMB3患者5年OS明显较低，表明癌组织中LAMB3的高表达可能导致膀胱癌的发生发展，有望成为评价预后的肿瘤标志物。本研究结果显示癌组织中LncRNA DDX11-AS1的表达与LAMB3的表达呈明显正相关。目前两者之间相互作用关系尚不清楚，可能是LncRNA DDX11-AS1可作为内源性竞争性RNA结合并抑制微小RNA-2355的表达，引起微小RNA-2355下游靶基因LAMB3水平升高[18]。因此，两者均可能是膀胱癌发生发展过程中重要标志物，但具体作用机制及临床意义有待深入研究。

综上所述，膀胱癌患者癌组织中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表达上调，且癌组织中LncRNA DDX11-AS1、LAMB3表达水平与肿瘤分期、淋巴结转移有关，LncRNA DDX11-AS1、LAMB3参与膀胱癌的发生发展，有望成为膀胱癌的新肿瘤标志物。