辐照灭菌对桃红丸主要成分的影响

李云霞，刘旭梅，王 宁，周 娜，刘建芳，王文习

桃红丸为我院开发的非标准制剂(制剂许可证号：总制字2016F202004)，具有活血化瘀、调经止痛的功效，在治疗关节炎、月经不调、冠心病、皮肤色斑方面疗效显著[1-4]。桃红丸由桃仁、红花、当归、川芎、赤芍等9味药组成，其中桃仁、红花为君药，是活血化瘀方剂中的经典组合。桃仁中主要含有各种脂肪酸、不饱和脂肪酸、甾醇及糖苷类，黄酮类化合物等[5]；红花主要含色素、黄酮类化合物，生物碱类，其中羟基红花黄色为最主要的有效成分[6-9]；当归、川芎、赤芍为臣药，主要的有效化学成分有芍药苷和阿魏酸、川芎内酯等[10]。由于处方中含有原药材粉末，现有的灭菌工艺有时不能达到微生物限度检查要求，需要60Co-γ辐照灭菌处理。

20世纪70年代以来，60Co-γ辐照灭菌在全世界广泛展开，由于其穿透力强、使用方便、省时省力、价廉、节能等特点，且在常温下就可达到理想的灭菌效果[11-13]。近年来辐照灭菌技术被广泛应用于医药食品行业、农业、工业生产等，中药制剂领域也开始普遍使用60Co-γ射线辐照灭菌[14-19]，尤其是对易挥发、热敏感的中药材及蜜丸的灭菌，更能体现出其优越性[20]。本研究通过建立辐照前后桃红丸的高效液相色谱(HPLC)指纹图谱，同时选取测定该制剂中的3种有效成分羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸在辐照前后的含量变化，考察辐射灭菌对桃红丸的影响，为辐照灭菌技术在中药制剂中应用提供科学依据。现报告如下。

1 仪器与试药

1.1试验仪器 安捷伦1100高效液相色谱仪(G1322型在线脱气机、G1311A型二元泵、G1313A型自动进样器、G1315B二极管阵列检测器、A.08化学工作站，美国Agilent公司)，BT214D型、BT125D型分析天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司)，雷磁PHS-3C型酸度计(上海仪电科学仪器股份有限公司)，KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2试验药品 乙腈为色谱纯(天津市康科德科技有限公司)；85%磷酸；甲醇为分析纯；水为超纯水。阿魏酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110773-201313；纯度以99.6%计)；芍药苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：110736-200630，纯度以95.7%计)；羟基红花黄色素A对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111637-301308)。桃红丸(批号：20180320)，桃红丸(批号：20180320，辐照剂量8 kGy)。

2 方法与结果

2.1色谱条件 色谱柱为Shimadzu VP-ODS C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，柱温为室温，流速1 ml/min；检测波长230 nm。以乙腈为流动相A，磷酸溶液(pH 2.6)为流动相B，梯度洗脱(0～20 min，95%～78% B；20～35 min，78%～70% B；35～45 min，70%～60% B；45～50 min，60%～25% B；50～51 min，25%～95% B)；平衡时间为10 min；进样量为20 μl。

2.2溶液制备

2.2.1对照品储备液的制备：精密称定羟基红花黄色素A、阿魏酸对照品各约10 mg，分别置100 ml量瓶中，精密称定芍药苷对照品约25 mg，置25 ml量瓶中，分别加入适量50%甲醇，超声处理2 min使其溶解，放至室温，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，获得每1 ml含羟基红花黄色素0.1 mg、阿魏酸0.1 mg和芍药苷1 mg的单一成分对照品储备液。

2.2.2混合对照品溶液的制备：精密量取羟基红花黄色素A对照品储备液1 ml、阿魏酸对照品储备液0.5 ml和芍药苷对照品储备液1 ml，置10 ml量瓶中，加50%甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.3供试品溶液的制备：取桃红丸细粉约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇液30 ml，称定重量，超声处理8 min，放至室温，加50%甲醇液补足减失的重量，摇匀，放置，上清液用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验：取空白溶剂(50%甲醇)和对照品溶液分别进样，记录色谱图，见图1。由图可知，空白溶剂不干扰测定。

图1 空白溶剂、对照品溶液和供试品溶液的指纹图谱

2.3.2线性与范围：取各对照品储备液逐级稀释成系列浓度的对照品溶液进行分析，记录3种对照品的色谱峰面积，以各指标成分的浓度(X，μg/ml)为横坐标，以色谱峰面积A为纵坐标(Y)，绘制标准曲线。见表1。结果表明3个指标成分在所测定的浓度范围内线性关系较好。

表1 桃红丸三种成分的线性与范围(n=5)

2.3.3精密度试验：取混合对照品溶液，连续进样6次，记录3个组分的峰面积。羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸峰面积的RSD值分别为1.5%、0.6%、1.9%。结果表明仪器的精密度良好。

2.3.4重复性试验：平行制备6份供试品溶液，进行分析，记录指纹图谱。记录供试品中各指标成分相应的峰面积，计算其含量，并将6次测定结果的RSD用于考察方法的重复性。供试品溶液中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸3个指标成分含量的RSD值分别为2.0%、2.6%和2.7%。结果表明该方法的重复性较好。

2.3.5回收率试验：精密称定桃红丸细粉约0.5 g，共6份，分别置具塞锥形瓶中，每个锥形瓶中分别加入羟基红花黄色素A对照品储备液2.5 ml、芍药苷对照品储备液1.5 ml和阿魏酸对照品储备液2.5 ml，再精密加入50%甲醇至30 ml，称定重量，按“2.2.3供试品溶液的制备”项下方法配制辐照后的供试品溶液，进行分析，记录指纹图谱。根据回收率=(测得量-样本含量)/加入量×100%计算3个指标成分的回收率。见表2。

表2 加样回收率的实验结果(n=6)

2.3.6稳定性试验：取辐照后桃红丸的供试品溶液，分别于0、3、6、9、24 h进样，记录色谱图。计算三个指标成分相应峰面积的RSD值以考察该溶液的稳定性。羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸的峰面积的RSD值分别为1.5%、1.7%和2.1%。结果表明供试品溶液在24 h内的稳定性良好。

2.4供试品含量测定 取辐照前与辐照后的供试品溶液和混合对照品溶液进行分析，并记录色谱图。采用外标一点法计算供试品中3个组分的含量。测得供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸辐照前的含量分别为0.5582 mg/g、3.1050 mg/g、0.4589 mg/g；供试品中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸辐照后的含量分别为0.5526 mg/g、3.1180mg/g、0.4625mg/g，辐照后含量无明显变化。

2.5相似度分析

2.5.1供试品对照指纹图谱的建立：取辐照前桃红丸细粉，制备供试品溶液，进行分析，记录指纹图谱。

2.5.2指纹图谱分析：取辐照后桃红丸细粉制备8份供试品溶液，分别进样，测定供试品的指纹图谱。

2.5.3相似度分析：采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》研究版(2004A)对辐照前后的指纹图谱进行分析，以辐照前样品的色谱图为参照图谱，采用多点校正，用中位数法生成对照指纹图谱和指纹图谱。见图2。处理数据，计算相似度，相似度均≥0.999。相似度计算结果可以看出辐照前后桃红丸的含量变化并无显著差异。

图2 桃红丸对照指纹图谱和供试品指纹图谱

3 讨论

本研究结果显示，所建立的指纹图谱方法验证结果良好，能够满足桃红丸辐照前后主要成分含量变化。辐照前后，桃红丸中羟基红花黄色素A、芍药苷和阿魏酸的含量均没有显著变化；辐照前后指纹图谱的相似度很高，没有峰个数的增加或缺失。实验过程对检测波长进行了考察，采用DAD全波长扫描检测器，在190～400 nm波长范围内扫描，分别在230、254、320、403 nm处对整个图谱进行比较，发现230 nm处下各成分具有较好的紫外吸收，出峰数目相对较多，各色谱峰峰形及分离效果相对较好，且基线较为平稳，故选择230 nm为测定波长。

该实验分别对体积分数为50%甲醇、甲醇、50%乙醇及乙醇为提取溶剂进行了考察，经过对比峰形、响应值、峰分离情况，甲醇的提取效果更好一点。随后又对体积分数为75%甲醇、50%甲醇、25%甲醇和水作了进一步考察，经过比较，最后选择体积分数为50%甲醇为提取溶剂。

该实验过程还对流动相进行了优选，首先选择甲醇-水进行考察，提取溶剂为体积分数为50%甲醇，进行指纹图谱的分析，但峰分离不好，基线上漂。随后又考察了甲醇-磷酸溶液(pH 2.6)、甲醇-磷酸溶液(pH 4)、甲醇-0.5%乙酸、甲醇-1%乙酸、甲醇-KH2PO4溶液(磷酸调至pH 4)、甲醇-KH2PO4溶液(30 mmol/L，pH3)、乙腈-水、乙腈-磷酸溶液(pH 2.6)等流动相体系，以色谱峰基线的平稳情况、指标成分的峰形以及分离效果为目标，最佳的流动相为乙腈-磷酸溶液(pH 2.6)。

综上所述，通过高效液相色谱法结合多指标定量测定法测定桃红丸较为可靠，该方法比较全面地反映了桃红丸的含量变化，可为其质量控制提供较为可靠的科学依据。