微核糖核酸-221对小鼠癫痫神经元细胞的作用及其机制研究

高 茜 赵红霞 李忠春 孟宪良

癫痫是中枢神经系统的慢性、反复发作性短暂功能失调综合征，其人群患病率仅次于脑卒中[1]。多数患者的病情经药物治疗后基本可得到控制，但仍有约20%的患者长期反复发作[2-3]。因此，研发有效的抗癫痫治疗药物具有重要临床意义[4]。微核糖核酸(microRNA，miRNA)为长度在19～25个核苷酸之间的短链、非编码、内源性小RNA，其可靶向结合mRNA的3’非翻译区(UTR)序列，调控基因转录的稳定性和翻译效率[5]。Simonato等[6]发现，miRNA参与的调控机制在癫痫疾病的防治中扮演重要角色。癫痫患者脑内的氧化应激反应活跃，癫痫发作时自由基(free radical，FR)含量显著增加，远超过机体对FR的清除能力。大量的FR可以直接使脂质、蛋白质和脱氧核糖核酸(DNA)等大分子物质发生氧化损伤，从而破坏细胞膜和其他细胞结构。当脑组织受到FR和内源性毒素等攻击时，核转录相关因子2(nuclear transcription-related factor 2，Nrf2)与其特异性受体KELCH样ECH相关蛋白1(Keap-1)解除偶联，半衰期明显延长，转位进入细胞核，与抗氧化反应原件(antioxidant response element，ARE)结合后诱导抗氧化蛋白和Ⅱ相解毒酶基因的表达。因此，考虑癫痫发生的相关机制可能与Nrf2-ARE信号通路的激活相关。本研究旨在探讨miRNA-221在小鼠癫痫神经元模型中的调节作用及其对上述信号通路的调控机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与试剂 小鼠神经元细胞株购自上海康朗公司。LipofectamineTM2000转染试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白质定量试剂盒、反转录试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。miRNA抽提试剂盒、人谷胱甘肽(GSH)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)印迹膜、电化学(ECL)发光液和放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白质裂解液均购自上海碧云天生物技术有限公司。磷脂结合蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。大鼠抗小鼠bcl-2、大鼠抗小鼠Bax、大鼠抗小鼠裂解的半胱天冬酶3(cleaved-Caspase3)、兔抗小鼠血红素氧化酶1(HO-1)、兔抗小鼠Nrf2多克隆抗体亦购自上海碧云天生物技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 神经元癫痫模型的建立与分组 参照Sombati等[7]的方法建立并改良癫痫神经元细胞株模型。小鼠神经元细胞株在维持培养液(Neurobasal基础培养液，2% B-27、1% 0.5 mmol/LL-谷氨酰胺、1%青霉素+链霉素)中培养14 d后，弃去维持培养液，随机分配至正常对照组、 miRNA阴性对照(miRNA-con)组和miRNA-221 mimic转染(miRNA-221)组，每组各12例样本，予如下处理。①正常对照组：在37 ℃ 5% CO2培养箱，置于维持培养液中，继续培养(时间同步其他两组)，用于后续试验。②miRNA-con组：将维持培养液更换为无镁细胞培养液[145 g氯化钠、2.5 g氯化钾、10 g 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)缓冲液、2 g氯化钙、10 g葡萄糖、0.002 g甘氨酸，溶于1 000 mL无菌水，用氢氧化钠调节溶液pH至 7.2]，即建立癫痫模型。培养3 h，以无血清正常细胞培养液清洗2遍，加入正常维持液培养液(每孔2 mL)，待细胞生长至50%融合面积(第14～21天)，使用DNA-lipo2000脂质体复合物(1 μg DNA∶1 μL脂质体)转染细胞株，每孔加入含20%胎牛血清+杜氏改良Eagle培养基(DMEM)的转染液1 mL，37 ℃培养48 h，用G418筛选培养液稀释细胞，每3～4 d更换筛选培养液，7 d后参照细胞克隆筛选法筛选转染成功的细胞株，培养至对数生长期用于后续试验。③miRNA-221组的mimic试剂转染比例和转染步骤同miRNA-con组。

1.2.2 实时荧光定量RT-PCR实验 应用miRNA抽提试剂盒提取小鼠神经元细胞株miRNA；按照反转录试剂盒说明书操作方法，采用茎环法合成模板链cDNA。并按照实时荧光定量RT-PCR试剂盒说明书要求的反应体系进行目的基因的PCR定量，每个样品重复3次，取平均值，以2-△△Ct法计算各组miRNA-221的相对表达水平。

1.2.3 ELISA实验 按照GSH检测试剂盒和MDA检测试剂盒说明书要求测定3组小鼠神经元细胞株的GSH、MDA含量。

1.2.4 免疫印迹实验 采用RIPA蛋白质裂解液对3组样本进行蛋白质裂解1 h，冰上操作；以BCA法检测提取的总蛋白质浓度。按比例在各样本中加入5×蛋白上样缓冲液，混匀，沸水中变性5 min，离心后取上清液60 μg蛋白质进行电泳。采用湿转法将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移至PVDF膜，以5%脱脂奶粉室温封闭各样本的PVDF膜1 h后，以1×TBST(Tris-盐酸、氯化钠和Tween 20)洗涤；4 ℃条件下，将PVDF膜浸入1∶1 000稀释的一抗中孵育过夜；孵育完成后以封闭液洗膜3次，每次5 min，后于37 ℃下将PVDF膜转入1∶2 000稀释的二抗中孵育2 h。按照ECL试剂盒说明书要求进行显影曝光。应用Image J系统分析目的条带灰度值，以目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值表示bcl-2、Bax、cleaved-Caspase3、HO-1和Nrf2的表达水平。

1.2.5 Annexin V-FITC/PI流式细胞术检测 采用结合缓冲液500 μL悬浮3组神经元细胞株，分别加入5 μL的 Annexin V、 FITC和PI，混匀，室温避光静置15 min。应用流式细胞仪测定并分析结果。细胞总凋亡率(%)=早期细胞凋亡率(%)+晚期细胞凋亡率(%)。每个样本重复3次。

2 结 果

2.1 miRNA-221过表达效率 miRNA-con组的miRNA-221表达水平(0.95±0.12)显著低于miRNA-221组(3.14±0.25,F=168.190，P<0.05)。

2.2 miRNA-221对细胞氧化应激的影响 miRNA-con组细胞的GSH表达水平(96.27±12.20)显著低于miRNA-221组(162.65±19.53，F=168.190，P<0.05)；miRNA-con组细胞的MDA表达水平(97.46±10.19)显著高于miRNA-221组(58.66±8.81，F=19.352，P<0.05)。

2.3 miRNA-221对细胞凋亡的影响 miRNA-con组细胞的凋亡率为(16.34±1.20)%，显著高于miRNA-221组[(8.75±1.53)%,F=27.115，P<0.05]，与正常对照组(15.71±1.46)%的差异无统计学意义(P>0.05)。与miRNA-con组相比，miRNA-221组细胞中抗凋亡蛋白质bcl-2表达水平显著升高，促凋亡蛋白质Bax和cleaved-Caspase3表达水平显著降低(P值均<0.01)。见表1。

表1 各组小鼠癫痫神经元细胞凋亡相关蛋白质表达水平比较

2.4 miRNA-221对细胞Nrf2信号通路的影响 miRNA-con组细胞中HO-1、Nrf2的蛋白质表达水平显著低于miRNA-221组(P值均<0.01)。见图1、表2。

1 正常对照组 2 miRNA-con组 3 miRNA-221组图1 小鼠癫痫神经元细胞Nrf2信号通路相关蛋白质的表达

表2 各组小鼠癫痫神经元细胞Nrf2信号通路相关蛋白质表达水平比较

3 讨 论

癫痫是常见的神经系统疾病之一。研究[6,8-9]发现，miRNA参与对癫痫的调控，但相关分子机制仍未明确。Ren等[10]研究发现，miRNA-181a的表达水平与癫痫持续的时间呈正相关，miRNA-181a拮抗剂可抑制Caspase3蛋白质的表达，减少癫痫诱导的神经细胞凋亡数量，对癫痫神经细胞发挥保护作用。Kan等[11]发现，miRNA-221和miRNA-222可靶向调节内源性细胞黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)的表达。研究[12]结果显示，miRNA-221可结合Nrf2及其下游相关基因的启动子片段;故本研究选择该miRNA作为干预靶点。本研究结果显示，与miR-221组相比，miRNA-con组中miRNA-221的表达水平较低；结合流式细胞术检测、免疫印迹实验结果证实，过表达miRNA-221可抑制该神经元细胞凋亡。

在本研究中，过表达小鼠神经元细胞株miRNA-221后，该细胞株HO-1、Nrf2的蛋白质表达水平均上调，细胞GSH的表达上调，MDA的含量下调；故过表达miRNA-221可抑制细胞氧化应激反应，提高细胞抗氧化应激能力。研究[13]发现，Nrf2可激活人类基因组中超过500个基因的转录，且大多数基因具有细胞保护功能。结合本研究结果推测，Nrf2通过影响多种基因的转录，有效协调和激活了细胞的抗氧化活性，并强化抗炎症反应作用，从而刺激线粒体生物发生，改善线粒体功能，激活自噬机制，清除有毒蛋白质聚集物和功能失调的细胞器[14-15]。有研究[16-17]报道，人体或模型动物中Nrf2高水平表达可有效抑制机体因慢性炎症反应诱发的相关疾病，包括各种心血管疾病、肾病、肺病、中毒性肝损伤、癌症、糖尿病、代谢综合征、肥胖、败血症、自身免疫性疾病、炎症性肠病、获得性免疫缺陷综合征和癫痫等。研究[18]结果表明，Nrf2与ARE结合，在氧化应激条件下诱导抗氧化剂和Ⅱ相解毒酶上调，从而抑制氧化损伤和毒性代谢物的累积。当活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生超过细胞降解能力时，会导致氧化应激[18]，损害细胞成分(包括脂质)，致使细胞生理功能下降和细胞死亡[19]。Wang等[20]研究结果证实，激活Nrf2信号通路与萝卜硫素抑制小鼠杏仁核的点燃相关，且可改善癫痫发作引起的认知障碍和氧化应激。笔者分析认为，Nrf2信号通路可能是癫痫治疗的重要靶点。凋亡、氧化应激、炎症反应是引发癫痫的主要病理机制，3个反应作为一个环路相互影响、相互促进，诱导癫痫的发生。

长链非编码RNA-尿路上皮癌胚抗原1(long non-coding RNA-urothelial carcinoembryonic antigen 1，lncRNA-UCA1)和Nrf2在癫痫样海马组织和神经元中表达均下调，而miRNA-221表达上调；且过表达的lncRNA-UCA1可负向调控miRNA-221对海马神经元凋亡的抑制，miRNA-221则可负向调节Nrf2[21-22]。在体内和体外实验中，视网膜母细胞瘤基因(retinoblastoma l，Rb1)可增强细胞Nrf2和HO-1表达，使bcl-2表达上调，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达下调，提示Rb1可通过激活Nrf2信号通路对戊四唑诱导的脑损伤和Mg2 +诱导的神经元损伤发挥保护作用。

综上所述，miRNA-221可减轻氧化应激和凋亡反应导致的小鼠癫痫神经元细胞损伤，为癫痫的治疗提供新靶点。