基于网络药理学探讨菟丝子、女贞子治疗绝经后骨质疏松症的作用机制

李慧文，曾令烽，陈海云

(1.广州中医药大学第二临床医学院，广州 510405； 2.广东省中医院骨伤科，广州 510120)

骨质疏松症是一种常见病，其主要病因是骨骼中骨量低，骨微结构损坏，无法保证骨骼韧性与强度，从而导致骨骼脆性增加[1]。在原发性骨质疏松症中，绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)发病率最高，对绝经后妇女的健康构成严重威胁，且对患者的日常生活造成极大影响[2]。PMOP与祖国医学中“骨枯”描述症状十分相似。《灵枢·经脉》：“足少阴而气绝，则骨枯已”。肾精亏虚，骨髓化生无源，无以滋养骨骼，枯槁易折。PMOP的辨证主要分为肾虚血瘀、脾肾两虚、肝肾阴虚和肾精亏虚4型[3]。由此可见，此病以肝脾虚和肾虚为主，同时伴有血瘀症，治疗上应以补肾填精为主，兼以活血化瘀、健脾益气养阴。

中医药治疗PMOP收效良好，既能减轻症状，又能改善患者的整体状态，且无明显毒副作用。菟丝子和女贞子是常用的药对。菟丝子黄酮具有促进机体产生内源性雌激素的作用，女贞子提取物中也存在雌激素样物质[4]，因而两者配伍治疗PMOP常事半功倍。本研究通过网络药理学探讨菟丝子、女贞子中有实际价值的活性成分、作用靶点及其相互作用，进一步预测菟丝子、女贞子抗PMOP的靶点，重点研究菟丝子、女贞子配伍治疗PMOP的可能作用机制。

1 资料与方法

1.1菟丝子、女贞子的潜在活性成分及作用靶标收集 以“TUSIZI”“NVZHENZI”为检索词，生物利用度≥30%、类药性≥0.18为筛选条件，在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)中检索获得菟丝子、女贞子的相关活性成分。

1.2菟丝子、女贞子作用靶标收集 从PubChem平台(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)获得菟丝子和女贞子具体活性成分对应的化学结构，并对其进行smiles格式调整。然后对其进行整理并导入Swiss Target Predictio平台(http://www.swisstargetprediction.ch/)进行药物活性成分靶标预测，物种选择“Homo Sapiens”。

1.3PMOP靶标收集 以“postmenopausal osteoporosis”为关键词，从人类孟德尔遗传数据库(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)、GeneCards数据库中收集PMOP有关的靶标。将UniPort数据库作为基础，完成确认、转换等步骤。对以上靶标进行整合，剔除其中的重复项和假阳性靶标，再通过Venny平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)完成药物相应的靶标及疾病关键靶标的映射，进而明确菟丝子、女贞子有效的活性成分并绘制韦恩图。

1.4药物-活性成分-疾病-关键靶标可视化网络的构建 经映射获得疾病、关键靶标以及活性成分间的关系，并通过Cytoscape V3.7.2中的自由度、介度与紧密度等对特征值进行拓扑，进而展开可视化分析，完成对药物-活性成分-疾病-关键靶标网络的建立。

1.5关键靶标蛋白质互作网络(protein-protein interaction network，PPI)的构建 在String v 11.0中录入关键靶标并进行物种设置，设成“Homo Sapiens”，即可实现对PPI网络的有效建立。然后在Cytoscape内导入所涉各项数据，并基于可视化分析的相关过程完成对PPI网络图的建立。

1.6菟丝子、女贞子作用靶标和关键靶蛋白可靠性验证及分子对接 本研究选取药物作用靶标的三维结构作为对接所用的蛋白，从RCSB Protein Data Bank平台(https://bivi.co/visualisation/rcsb-protein-data-bank)下载菟丝子、女贞子作用靶标的三维结构，以ChemBio3D Ultra 17.0完成对靶蛋白三维结构的可视化处理，然后通过MMFF94力场完成相关调整。蛋白、化合物均通过AutodockTools 1.5.6将格式转化为PDBQT格式。通过Autodock vina 1.1.2[5]完成分子对接处理，并将参数exhaustiveness调整为20，选择优质的构象后使用Pymol软件显示其三维结构。

1.7关键靶标生物功能注释及通路分析富集 使用R 4.0.5进行基因本体(Gene Ontology,GO)和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)分析，GO富集对生物过程、细胞组成、分子功能进行分析，通路分析选择KEGG，设置校正后的P<0.05，并绘图。

2 结 果

2.1菟丝子、女贞子的潜在活性成分筛选 以生物利用度≥30%、类药性≥0.18作为筛选标准，于TCMSP数据库内完成筛选，共获得菟丝子潜在活性成分11个，女贞子潜在活性成分13个，见表1。

表1 菟丝子、女贞子的潜在活性成分

续表1

2.2菟丝子、女贞子配伍治疗PMOP的潜在作用靶标预测 完成菟丝子、女贞子潜在活性成分筛选后，将其smiles格式向Swiss Target Prediction平台中进行转移，共获得两植物的潜在作用靶标572个，其中菟丝子282个，女贞子290个。排除重复靶标后，菟丝子靶标共190个，女贞子则降至170个。基于OMIM与GeneCards数据库，疾病靶标共1 296个，对其进行重复靶标排除后梳理出不同的疾病靶标共1 130个。通过Venny平台绘制韦恩图(图1) ，经映射处理后，筛选出疾病、药物同时作用的靶点共113个，菟丝子起作用的靶标107个，而归属女贞子的104个，两者共同靶标98个。对应的活性成分共18个，其中菟丝子10个，女贞子8个。

2.3药物-活性成分-疾病-关键靶标可视化网络构建及分析 将菟丝子、女贞子与PMOP共同的靶标及相关活性成分等信息添加到Cytoscape中，进一步建立与绘制药物、活性成分-疾病-关键靶标之间可视化网络，见图2。与关键靶标存在直接相关性的活性成分共15个，其中12个活性成分能与3个以上的关键靶标相连，包括芝麻素、异鼠李素、β谷甾醇、山柰酚、异黄酮、苦参碱、胆固醇、槲皮素、女贞果苷D_qt、紫杉醇、木犀草素、圣草酚。关键靶标中度值前5的分别为前列腺素内过氧化物合成酶(prostaglandin-endoperoxide synthase，PTGS)1、PTGS2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferative activated receptor γ,PPARγ)、核因子κB p65(nuclear factor κB p65,RELA)、胱天蛋白酶3(caspase-3)。

2.4关键靶标PPI网络 于String数据库中获取蛋白质间的互作关系，再将相关数据添加到Cytoscape中，完成对蛋白质互作网络图的绘制，蛋白质互作网络图见图3。其中含关键靶标113个，条边共17 030个。Degree值排名前10的分别是JUN、RAC-α丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(RAC-α serine/threonine-protein kinase,AKT1)、促分裂原活化的蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)1、白细胞介素(interleukin,IL)-6、RELA、MAPK8、MAPK14、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)、雌激素受体1(estrogen receptor 1,ESR1)、血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)。

节点大小采用以Degree值表示，节点随值增大而增大；Combine socre值的大小反映边的粗细，Combine socre值越大，边越粗

2.5菟丝子、女贞子作用靶标和关键靶蛋白分子对接可靠性验证及结果 通过分子水平描述化合物β谷甾醇、异鼠李素、山柰酚、木犀草素、槲皮素与PTGS1、PTGS2、PPARγ、RELA、caspase-3的作用模式，将上述成分进行分子对接，其亲和力见表2，并取得分最高的β谷甾醇和PPARγ作图分析，其理论结合模式见图4～7。

PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ

表2 使用分子对接软件Autodock Vina进行对接打分 (kcal/mol)

2.6关键靶标生物的功能注释及通路分析 经GO功能相关注释显示，菟丝子和女贞子存在关键靶标的主要功能为DNA结合转录因子结合、RNA聚合酶Ⅱ特异性等，见图8。通过对KEGG通路富集分析结果显示，筛选出主要的富集通路有糖尿病并发症的晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体信号通路、流体剪切应力以及动脉粥样硬化信号通路、IL-17信号通路、肿瘤坏死因子信号通路等，见图9。

PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ

紫色箭头：氢键方向 PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ

紫色：蛋白；蓝色：配体 PPARγ：过氧化物酶体增殖物激活受体γ

图8 菟丝子和女贞子关键靶标的生物功能注释富集分析

KEGG：京都基因和基因组百科全书

3 讨 论

女性在绝经期后雌激素水平显著下降，导致身体骨钙含量大量流失，出现骨质疏松，西医治疗以预防骨质丢失、抑制骨吸收为主，并不能从根本上改善骨代谢情况，且存在一定的不良反应[6]。而中药治疗PMOP的效果显著、无毒副作用的优点而被大多数PMOP患者所接受。

《开宝本草》言：“菟丝子味辛、甘、平，无毒……强阴，坚筋骨。”亦有文献佐证菟丝子药用成分，菟丝子黄酮可抑制去卵巢骨质疏松大鼠的骨代谢，还可调节骨产生与骨吸收的关系，加快机体雌激素的生成速度，从而预防雌激素降低引发的骨质疏松症[7-8]。《本草新编》云：“女贞子味苦、甘，气平，无毒，入肾经……壮筋强力。”现代药理研究证明，女贞子提取物可有效抑制破骨细胞的分化以及骨吸收功能，调节成骨细胞的增殖，从而进一步预防骨质流失[9]。无论是祖国医学还是现代医学，菟丝子和女贞子在治疗骨质疏松症方面均有良好的疗效。菟丝子偏温，女贞子偏凉，两者合用可发挥平补的作用，而菟丝子填肾精，女贞子滋肾阴，两者合用，补益肝肾，填精益髓，能有效缓解PMOP患者腰膝酸软、周身骨痛、潮热盗汗的症状。若患者出现脾肾阳虚腹泻时则应考虑去女贞子，加用温阳药物(如鹿茸、淫羊藿、附子、肉桂)进行治疗。

本研究使用PPI网络筛选出菟丝子、女贞子配伍治疗PMOP关联度最高的基因包括JUN、AKT1、MAPK1、IL-6、RELA、MAPK8、MAPK14、EGFR、ESR1、VEGFA等。在PMOP的发病过程中，破骨细胞破坏骨质，而IL-6是重要的破骨细胞调节因子之一[10-11]，可与肿瘤坏死因子-α等细胞因子协同调控细胞炎症反应，并与IL-17信号通路密切相关。临床上PMOP患者血清中IL-6和肿瘤坏死因子-α水平多有升高。AKT1参与调控细胞增殖和生长，与成骨细胞相关，可调控骨形成的速度[12]。在骨形成与血管生成偶联机制中，成骨细胞及其前体细胞可通过分泌VEGF相关细胞因子(如VEGFA)参与骨血管生成的调控，还可参与骨生成及骨重建[13]。体外实验证明，EGF可以激活破骨细胞，加快骨吸收的速度，还可抑制成骨细胞[14]，与EGFR共同参与成骨破骨的过程。JUN蛋白能与Fos家族内的蛋白发生聚合反应并变成异源二聚体，从而担负起转录因子角色，发挥促进骨细胞凋亡的作用[11]。研究表明，JUN蛋白包含c-Jun、JunB、JunD，三者可以两两结合形成同源二聚体，也可以与Fos家族的蛋白形成异源二聚体，从而发挥转录因子的作用，参与调节骨质疏松症中成骨细胞的凋亡[15]。

本研究通过KEGG富集研究显示，菟丝子、女贞子可以通过糖尿病并发症晚期糖基化终末产物-晚期糖基化终末产物受体通路作用于IL-1、IL-6、IL-8、caspase-3等靶点，从而达到有效治疗PMOP的目的。研究表明，2型糖尿病与维生素D之间存在密切联系，糖代谢与骨代谢之间也存在紧密关联，胰岛素拮抗程度越高，发生骨质疏松症的可能性越大[16-17]；相关研究指出，菟丝子、女贞子均具有抗炎、抗氧化、抗骨质疏松、控制血糖的作用[18-19]。骨质疏松症与颈动脉硬化均是绝经后妇女的常见病,有大型流行病学研究提示骨质疏松症与颈动脉硬化显著相关[20]。还有研究显示，PMOP患者血清IL-17水平高于绝经后骨质正常和骨量降低的患者[21]。

破骨细胞在破骨过程中打开微小的孔洞，然后再被成骨细胞填满，其中重要的凿孔分子是超氧自由基(·O2-)[22]。研究发现菟丝子和女贞子均有清除氧自由基的作用[23]。缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)对破骨细胞的形成有促进作用，且能显著提高破骨细胞活性[24-26]。动物实验研究表明，去卵单小鼠破骨细胞内HIF-1α水平升高，骨代谢破骨指标Ⅰ型胶原交联C端肽(C-terminal telopeptide of collagen type 1,CTX-1)也升高，导致骨质疏松症，若给予去卵巢小鼠HIF-1α抑制剂2-甲氧雌二醇，则破骨细胞内的HIF-1α水平较前下降，同时骨代谢破骨指标CTX-1也较前下降，骨质疏松程度有效减轻[25]。表明HIF-1α参与PMOP相关过程，可加重骨质疏松程度。对去卵巢小鼠给予HIF-1α抑制剂后，其骨代谢指标CTX-1开始出现下降，破骨细胞活性被抑制，减少骨质疏松症的发生。因此，结合临床及现代药理学推测菟丝子、女贞子配伍可能通过抗氧化抑制破骨细胞骨吸收作用达到抗PMOP的目的。另外，本研究KEGG通路结果显示，部分通路之间存在协同作用，如调控成骨细胞的HIF-1通路，使VEGF和其他血管发生相关因子过表达，可促进骨血管生成和骨形成[27]。以往研究证实，Hippo信号通路与骨代谢密切相关，而骨代谢的稳定是在成骨细胞与破骨细胞的骨吸收-形成平衡的基础上实现[28]。Hippo-YAP信号通路是目前研究的热点，补肾中药通过该通路治疗骨质疏松症的作用机制仍需进一步研究完善。

综上所述，菟丝子、女贞子可通过不同的信号通路抑制破骨细胞分化及活性，减少骨质流失，促进成骨细胞分化和活性，以及类激素作用，从而达到治疗PMOP的目的。但是菟丝子、女贞子对肠钙吸收是否有促进作用尚未得到证实，仍需要进行更深入的实验探究，从而明确菟丝子和女贞子有效活性成分作用的基因或蛋白，为治疗绝经后骨质疏松症提供新的思路。