胶质瘤组织miR-3653的表达及miR-3653对胶质瘤TG905细胞侵袭、迁移的影响

范光亮 周云飞 张志龙

胶质瘤是最常见的颅内恶性肿瘤，具有高发病率和高病死率的特点[1]。当前，临床上的治疗手段通常为手术切除、放疗和化疗，也有应用靶向治疗[2]。然而，胶质瘤的预后非常差，中位生存期仅10～15个月[3]，高级别胶质瘤预后更差。导致胶质瘤整体生存时间短、生活质量低的潜在原因，一般认为是胶质瘤的恶性侵袭和远处迁移[4]。因此，寻找有效的预后标志物有助于胶质瘤预后判断，可以进一步指导胶质瘤的治疗。文献报道miR-3653 对肝癌细胞的侵袭和迁移具有抑制作用[5]。本文探讨miR-3653对胶质瘤细胞侵袭和迁移的影响。

1 材料与方法

1.1 标本来源 选取2017 年1 月至2019 年3 月手术切除的胶质瘤组织25 例，其中男15 例，女10 例；平均年龄（62.96±5.86）岁；WHO分级Ⅱ级3例，Ⅲ级13例，Ⅳ级9 例；所有病人术前均未行抗肿瘤治疗，切除胶质瘤及瘤旁2 cm处脑组织，放入液氮保存。

1.2 细胞培养 将TG905细胞从液氮中取出，37 ℃快速融化，置于含10%胎牛血清（美国Gibco 公司）的DMEM培养基（美国Gibco公司）中培养，待细胞长至80%的融合度时，进行传代处理，培养3～4代后，取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 瞬时转染 待细胞融合度达到60%以上时，使用LipfectamineTM 2000（美国Invitrogen 公司）进行转染，严格按照说明书进行操作。过表达组转染MiR-3653 mimic 质粒，过表达对照组转染NC-MiR-3653 mimic质粒，抑制对照组转染NC-MiR-3653 inhibitor质粒，抑制组转染MiR-3653 inhibitor 质粒，miR-3653+ZEB2 过表达组同时转染miR-3653 mimic 和ZEB2 mimic质粒。

1.4 实时定量PCR 检测mRNA 表达 使用TRIzol 法提取胶质瘤组织总RNA，使用cDNA 反转录试剂盒（美国Invitrogen公司）反转录为cDNA，以U6和GAPDH 为内参。U6 引物：正义链5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反 义 链5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'；GAPDH 引物正义链5’-TGTAGTTGAGGTCAATGA AGGG-3'，反义链5'-ACATCGCTCA GA CACCATG-3'；miR-3653 引物 正 义 链5'-TCTCCCGAG AGACATATTT-3'，反义链5'-GATGAGAAGGTATGAATCA-3'。反应体系为20 μl：2×SYBR Premix 10 μl，H2O 8 μl，cDNA 1 μl，上下游引物个0.5 μl。反应条件为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 s、60 ℃退火30 s，72 ℃30 s，40个循环。根据2-ΔΔCt算法计算mRNA 表达量。

1.5 免疫印迹法检测蛋白表达 使用RIPA 蛋白提取试剂盒（上海碧云天生物技术公司）进行细胞总蛋白提取。加入适当的RIPA 裂解液，冰上收集细胞，每隔3 min 震荡一次。12 000 转/min 离心10 min，收集上清液。使用SDS-PAGE 凝胶进行电泳分离蛋白，湿转将蛋白转到PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，加入一抗4 ℃过夜孵育，加二抗室温孵育1.5～2 h 后，进行曝光处理。以GAPDH 为内参，采用Image J 软件分析每个蛋白条带灰度值与GAPDH 条带灰度值之比，以其比值作为目的蛋白表达水平。

1.6 胶质瘤细胞侵袭能力的检测 使用Transwell 法检测胶质瘤细胞的侵袭能力。用无血清培养基制备含有胶质瘤细胞的细胞悬液，加入适当细胞悬浮液到上室中。然后，将含10%胎牛血清的DMEM 加入到下室中。细胞孵育24 h后，使用结晶紫染色，并在倒置显微镜（200倍）下，对随机5个视野区域进行观察，进行细胞计数，重复3次。

1.7 胶质瘤细胞迁移能力的检测 使用划痕实验检测胶质瘤细胞的迁移能力。将细胞接种到12孔中，待其全部长满，使用100 μl的枪头进行划痕，用PBS将划掉细胞洗净，同时加入无血清培养基进行培养。处理0、48 h 后，在倒置显微镜下观察并拍照。细胞迁移率=（0 h划痕宽度-48 h划痕宽度）/0 h划痕宽度×100%。重复3次。

1.8 统计学处理 使用SPSS 20.0软件分析；定量资料采用±s表示，行t检验和单因素方差分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胶质瘤组织miR-3653 的表达 与瘤旁脑组织相比，胶质瘤组织miR-3653表达量明显下调（P＜0.05，图1）。

图2 miR-3653 过表达对胶质瘤TG905 细胞EMT 标志分子mRNA表达的影响

2.2 过表达miR-3653 抑制TG905 细胞的上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）能力与过表达对照组相比，过表达组上皮型钙黏蛋白mRNA 水平明显升高（P＜0.05），而神经型钙黏蛋白和波形蛋白mRNA水平明显降低（P＜0.05）。见图2。

2.3 miR-3653抑制胶质瘤TG905细胞的侵袭和迁移能力 与过表达对照组相比，miR-3653 过表达组miR-3653 水平显著提高（P＜0.05，图3A），明显抑制TG905细胞的迁移和侵袭（P＜0.05，图3B、3C）。与抑制对照组相比，miR-3653 抑制组miR-3653 水平显著降低（P＜0.05，图3D），明显促进TG905 细胞的迁移和侵袭（P＜0.05，图3E、3F）。

图3 miR-3653对胶质瘤TG905细胞侵袭和迁移的影响

图4 miR-3653对胶质瘤TG905细胞ZEB2表达的影响

2.4 过表达miR-3653 抑制TG905 细胞ZEB2 表达与过表达对照组相比，过表达组ZEB2表达水平明显降低（P＜0.05，图4A、4B）。与抑制对照组相比，抑制组ZEB2表达水平明显升高（P＜0.05，图4C、4D）。

图5 过表达ZEB2抑制miR-3653对胶质瘤TG905细胞的作用

2.5 过表达ZEB2 抑制miR-3653 对TG905 细胞的作用 与过表达组相比，miR-3653+ZEB2 过表达组上皮型钙黏蛋白mRNA和蛋白水平明显降低（P＜0.05，图5A、5B），而神经型钙黏蛋白和波形蛋白mRNA和蛋白水平明显增高（P＜0.05，图5A、5B），TG905 细胞的侵袭和迁移能力显著增加（P＜0.05，图5C）。

3 讨论

某些参与肿瘤进展的相关蛋白被报道为胶质瘤病人预后的潜在生物标志物，然而由于特异性和敏感性有限，只有少数在临床中具有实用价值。随着表观遗传学的发展，许多miRNA被认为是胶质瘤发生发展过程中的重要调控因子，可调节肿瘤细胞增殖和耐药性[6]。某些miRNA可以作为肿瘤的诊断和预后预测的生物标志物以及治疗靶点[7]。本研究发现胶质瘤组织miR-3653 表达下调；过表达miR-3653 明显抑制胶质瘤TG905 细胞的迁移和侵袭，而其表达下调则增强胶质瘤TG905 细胞的侵袭能力。这表明过表达miR-3653，可通过抑制胶质瘤细胞的侵袭而发挥抗肿瘤作用。

EMT 是肿瘤转移的重要机制之一，上皮型钙黏蛋白、神经型钙黏蛋白和波形蛋白是EMT的标志分子。在EMT 过程中，肿瘤细胞失去上皮特征，获得间质表型，从而增强转移能力[8]。本文结果显示过表达miR-3653 导致上皮型钙黏蛋白表达水平明显升高，神经型钙黏蛋白和波形蛋白表达水平明显降低，而抑制miR-3653 则相反。这表明，过表达miR-3653明显抑制胶质瘤TG905细胞EMT能力。

研究显示，转录因子（比如Twist 和Zeb 蛋白）是肿瘤细胞EMT 过程中的关键调控因子[9，10]。有文献报道，ZEB2 含有miR-3653 的互补序列，miR-3653可以通过这些互补序列与ZEB2的3'-UTR相互作用[11]。本研究结果显示过表达miR-3653 明显抑制胶质瘤TG905细胞ZEB2的表达；反过来，过表达ZEB2则明显抑制miR-3653 过表达对胶质瘤TG905 细胞的作用。

总之，胶质瘤组织miR-3653 呈低表达，通过靶向上调ZEB2，促进细胞上皮-间质转化及细胞侵袭、迁移能力。这提示miR-3653 可能会成为胶质瘤新的生物标志物和治疗靶点。