从网络药理学角度探究骨碎补治疗骨折类疾病的作用机制

张来福，卢承印，王孝辉，武爱玲

(1.河南中医药大学，河南 郑州450046；2.河南省洛阳正骨医院/河南省骨科医院，河南 洛阳 471002)

骨折以交通伤害为首要致病因素[1]。骨折不愈合时不仅影响患者的身体健康，还会造成心理问题，降低患者生活质量[2]。因此如何促进骨折愈合，降低骨折对患者的影响成为治疗的关键。在固定断骨的同时，配合促进骨痂生长的药物是临床治疗骨折的常用手段[3-4]。在传统医学中，有诸多促进骨折愈合的中草药，如骨碎补、杜仲、续断等[5]。临床也常用含有骨碎补的方剂治疗骨折[6-7]，并取得了较好的疗效，但骨碎补促进骨折愈合的作用机制仍未完全明确。

中药骨碎补(Rhizoma drynariae)是水龙骨科植物槲蕨(Drynariafortunei(Kunze)J.Sm.)根茎的加工品，味苦性温，归肝肾经，具有疗伤止痛、补肾强骨、消风祛斑的功效，临床常用于跌扑闪挫、筋骨折伤、肾虚腰痛、筋骨痿软、耳鸣耳聋、牙齿松动、外治斑秃、白癜风的治疗[8]。《素问·宣明五气篇》中指出“肾主骨，肝主筋”。《备急千金要方》一书也提到“肾应骨，骨与肾合”“肝应筋，筋与肝合”的相关理论。《素问·阴阳应象大论篇》中云：“肾生骨髓，在体为骨”，说明肾主骨生髓，骨是人体的支架。在骨折治疗时，若肾生骨髓不足，则骨无以养、骨难愈合[9]。因此，在骨折的治疗中须配合补肾强骨之法。

网络药理学是将化学基因组学与网络药理生物学相结合的新学科，2007年首次被Hopkins AL[10]提出，旨在构建“药物-靶基因-疾病”网络，从整体上分析药物成分与疾病中多成分、多靶基因、多通路的关系，从而揭示药物治疗疾病中潜在的有效成分、作用靶基因及通路。本文通过网络药理学的方法构建“骨碎补-活性成分-靶基因-骨折”的调控网络(详细研究步骤见图1)，研究骨碎补治疗骨折的作用机制。

图1 网络药理学研究骨碎补促进骨折愈合作用机制步骤

1 分析方法

1.1 骨碎补有效成分筛选

中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine system pharmacology，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)是根据中草药系统药理学的框架建立，用于药物筛选和评估，可以提供中草药活性成分及其对应的靶基因、目标疾病等信息[11]。在TCMSP中检索骨碎补活性成分及对应靶基因，以口服生物利用度(Oral bioavailability，OB)≥30%、药物相似度(Drug-likeness，DL)≥0.18的条件进行筛选[12]，结果共得到18种活性成分及其各自对应靶基因(见表1)。利用软件perl(https：//www.perl.org/)和基因库Uniprot(https：//www.uniprot.org/)为靶基因进行注释得到基因名，并排除无法找到基因名的靶基因。

1.2 骨折对应靶基因筛选

以骨折(fracture)为关键词分别在GeneCards(https：//www.genecards.org/)和OMIM(https：//www.omim.org/)数据库中搜索相关靶基因。

1.3 筛选骨碎补-骨折对应靶基因的交集

利用软件R(https：//www.r-project.org/，版本3.6.1)对骨碎补与骨折靶基因取交集，得出骨碎补-骨折共同靶基因的venny图(见图2)，并从中得到骨碎补-骨折的靶基因列表。

1.4 构建“骨碎补-活性成分-共同靶基因-骨折”调控网络

利用软件perl和Cytoscape(https：//cytoscape.org/，版本3.7.2)对骨碎补、有效活性成分、骨折、共同靶基因进行计算画图，得到“骨碎补-活性成分-骨折-共同靶基因”的调控网络(见图3)。

1.5 构建“骨碎补-骨折共同靶基因”蛋白相互作用网络(protein-protein interaction network，PPI网络)，筛选核心靶基因

将“骨碎补-骨折靶共同基因”输入软件STRING(https：//string-db.org/cgi/input.pl)，同时以人类(Homo sapiens)为选择条件，以0.4为最小互作分数，得到相应结果(图4)。并将结果输入R软件中，进而得到PPI网络核心靶基因图(图5)。

1.6 GO功能富集分析

GO(Gene Ontology)分析通过在数据库(org.Hs.eg.db)中对基因进行细胞成分、生物学过程、分子功能三部分的描述，进而得到基因的注释信息，通过比较得到差异表达基因，进一步得到GO富集分析。将“骨碎补-骨折共同靶基因”输入软件R，利用相应脚本得到GO功能富集分析图(图6)。以P<0.05为差异具有统计学意义。

1.7 KEGG通路富集分析

KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通过将生物体内所有通路进行富集分析，检测目标基因是否在某类通路中富集而得到的结果。将“骨碎补-骨折共同靶基因”输入软件R，利用相应脚本得到KEGG通路富集分析图(图7、图8)。以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨碎补有效活性成分筛选

依据上述标准进行筛选，结果共得到18种活性成分和304个对应靶基因。见表1。

表1 根据OB和DL参数在TCMSP数据库中对骨碎补活性成分筛选结果

2.2 骨碎补-骨折对应的靶基因交集

在软件R中利用脚本对骨碎补与骨折靶基因取交集，得出骨碎补-骨折共同靶基因的venny图及共同靶基因列表。其中骨折对应相关靶基因有3 490个，骨碎补对应靶基因有77个，骨碎补-骨折共同靶基因有55个。

图2 骨碎补-骨折靶点

2.3 “骨碎补-活性成分-骨折-共同靶基因”调控网络

从图3中得知骨碎补有14种活性成分，分别为：柚皮素((2R)-5，7-dihydroxy-2-(4-hydroxyphenyl)-chroman-4-one)、金鱼草素(Aureusidin)、豆甾醇(Stigmasterol)、去甲异辛醇(黄烷酮)(Eriodyctiol (flavanone))、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、山奈酚(kaempferol)、柚皮苷(naringenin)、(+)儿茶素((+)-catechin)、圣草素(eriodictyol)、木犀草素(luteolin)、22-豆甾烯-3-酮(22-Stigmasten-3-one)、环木菠萝烯酮(cycloartenone)、大蒜素(davallioside A_qt)、黄姜烯醇(xanthogalenol)。其中圣草素OB最高，为71.79%；环木菠萝烯酮DL最大，为0.79；活性成分连接靶基因最多的是山奈酚、木犀草素，分别连接26、25个靶基因。在骨碎补治疗骨折的过程中，可能通过这14种有效成分作用于55个共同靶基因促进骨折愈合。

注：图中部分代表药物骨碎补，部分代表疾病骨折，部分为骨碎补中活性成分，部分为靶点。

2.4 “骨碎补-骨折靶基因”PPI网络

图4中每个节点代表一个基因片段，节点内填充为基因形状(未填充为基因片段形状未明确)。连线代表节点之间的相互作用，节点连线越多则代表成为核心基因的概率越大。图中共有407条连线，其中互作分数最高的为IKBKB-NFKBIA、CASP7-CASP8、CASP8-CASP3、NCOA2-AR四条连线，互作评分均为0.99。

图4 骨碎补-骨折PPI网络

2.5 PPI网络核心靶基因

柱状图清晰显示节点连线多少，自下至上节点连线依次减少，其中IL-6(白介素-6)最多，有39条连线，其次是EGFR(epidermal growth factor receptor，表皮生长因子受体)和VEGFA(vascular endothelial growth factor A，血管内皮生长因子A)，均为33条。

2.6 GO功能富集图

共同基因共得到73种功能富集，部分核心基因功能富集结果见图6。由图中得知，功能富集程度最高的分别为类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity，8个基因)、核受体活性(nuclear receptor activity，7个基因)、转录因子活性(transcription factor activity)、类固醇结合(steroid binding，7个基因)、参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process，7个基因)。因此骨碎补在治疗骨折类疾病时，可能是14种有效成分作用于55个共同靶基因通过调控上述受体活性发挥作用。

注：该图左列为基因名称，数字表示与邻近节点的连线多少。

注：左列为对应的GO号；数字代表基因富集数目；P值表示富集程度高低，P值越小、颜色越深，表示富集程度越高。

2.7 KEGG通路富集分析

共得到101条KEGG通路，取部分通路作图，结果见图7、图8。由图中得知，通路富集程度最高的分别为前列腺癌(Prostate cancer)、流体剪切应力与动脉粥样硬化(Fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、卡波西氏肉瘤相关疱疹病毒感染(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、EB病毒感染(Epstein-Barr virus infection)等通路。因此骨碎补在治疗骨折类疾病时，可能是14种有效成分作用于55个共同靶基因通过上述通路对73种受体活性发挥调控作用。

图8是标注节点后的通路图，其中每个节点代表一个蛋白、酶或基因，箭头代表上下游之间的作用关系，红色标注的节点表示出现在调控网络中，未进行标注的节点表示未曾出现在调控网络中。

3 讨论

在中医理论中，肾藏精、主骨、生髓，肾精盛衰决定骨骼的生长速度，因此在治疗骨折类疾病时，当以补肾强骨为要，而骨碎补为补肾强骨要药，在临床有很多骨碎补促进骨折愈合的报道[13-14]。在笔者前期研究中[15]，也证实了骨碎补的提取物骨碎补总黄酮能促进大鼠诱导膜中血管内皮生长因子(VEGF)和骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的表达，而VEGF能促进微小血管增生，BMP-2诱导成骨能力强，VEGF和BMP-2表达的增加可加速促进骨折愈合。骨折愈合通常经历三个阶段：炎症阶段、修复阶段、细胞重塑阶段。骨骼损伤后会引发炎症反应、形成血肿，随后到达修复阶段形成软骨愈伤组织、矿化，最后经过成骨细胞和破骨细胞的作用进行重塑，恢复骨骼结构[16-18]。

注：左列表示通路名称；下行数字表示通路上基因富集数目；P表示富集程度，其中P越小、颜色越深表示富集程度越高。

注：左上角为通路名称Prostate cancer，该通路中共有13个不同基因富集。

本研究结果表明，骨碎补在治疗骨折类疾病时共有14个有效活性成分，其中邻近节点连线最多的是山奈酚和木犀草素。据文献报道，山奈酚不仅能诱导细胞对抗肿瘤药物的耐受作用[19]，而且具有抗癌、抗心血管疾病、抗炎、抗糖尿病、促进骨折愈合、抗血小板聚集等作用[20]。促进骨折愈合的作用中，山奈酚能改善细胞活力，通过提高碱性磷酸酶(ALP)的活性促进成骨基因的表达，通过诱导自噬进而促进成骨细胞的分化、增殖、矿化[21]，同时具有抑制破骨细胞骨吸收的作用[22]。木犀草素具有抗肿瘤[23]、抗炎[24]、抗衰老[25]等作用。尚丹等[26]研究发现木犀草素能促进成骨细胞的增殖、分化、矿化；Quan He等[27]也发现木犀草素能促进人体成骨细胞的分化；Lucía等[28]证实木犀草素能通过促进ALP的合成进而有利于成骨细胞的分化。Kim等[29]证实木犀草素可抑制破骨细胞的分化和成熟破骨细胞的吸收活性。OB最高的圣草素能通过抑制NFATc1活性抑制RANKL诱导的破骨细胞的形成和骨吸收[30]；而DL最大的环木菠萝烯酮尚缺乏有效研究。因此骨碎补促进骨折愈合是山奈酚、木犀草素等多种有效成分共同发挥作用的结果。

在PPI网络中，骨碎补活性成分-骨折对应的共同靶基因IL-6、EGFR、VEGFA是连线最多的节点。其中IL-6可刺激淋巴细胞和巨噬细胞进入骨折部位，对于骨折的愈合起着重要作用[31]。EGFR及其信号通路对调控成骨细胞、破骨细胞增殖、分化具有重要的生物学作用[32]。高水平的VEGFA有助于促进骨折愈合及功能恢复[33]。因此骨碎补促进骨折愈合是IL-6、EGFR、VEGFA等多核心基因共同调节的结果。

在GO功能富集中，富集程度最高的分别为类固醇激素受体活性、核受体活性、转录因子活性等。类固醇激素受体是包括雌激素受体、雄激素受体、糖皮质激素受体在内的一类受体[34]。雌激素和雄激素在骨形成中不可或缺，研究表明[35]，雌激素能通过调控成骨细胞和破骨细胞的活性，对骨量和骨骼强度的调节产生关键作用。也有研究[36-37]表明雌激素通过延长成骨细胞的寿命和缩短破骨细胞的寿命发挥作用，且雌激素的缺乏会影响骨折早期的炎症反应和骨折的愈合。雄激素能通过影响成骨细胞、骨细胞的表达，骨转换标记、骨小梁的变化等多方面因素影响骨生长、骨形态以及骨重建，对骨骼生长发育和维持骨量发挥着重要作用[38]。糖皮质激素不仅对炎症性骨科疾病有治疗作用，而且能通过影响骨髓细胞、破骨细胞、间充质细胞、软骨细胞、成骨细胞的功能对骨折患者发挥治疗作用[16，39]。核受体是包含雌激素、雄激素、糖皮质激素在内的超家族，同样对骨折的愈合发挥调控作用[40]。

KEGG通路富集的结果显示，富集程度最高的为前列腺癌通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、TNF信号通路等。每条通路中都包含多个共同靶基因，以富集程度最高的前列腺癌通路为例，其中有13个骨碎补活性成分-骨折共同对应的靶基因，这些基因对应的功能富集包含类固醇激素受体活性、核受体活性等在内的多种功能活性。在标注节点通路图中可以发现，前列腺癌通路中包含PI3K-Akt、Apotosis、p53、MAPK等信号通路；流体剪切应力与动脉粥样硬化通路包括MAPK、NF-κB、PI3K-Akt等信号通路；TNF通路包括MAPK、PI3K-Akt、Apotosis、NF-κB等信号通路。MAPK、PI3K-Akt、NF-κB等信号通路均能参与炎症反应阶段，有效控制促炎性细胞因子的释放[41]，MAPK也能参与调控成骨细胞的凋亡[42]；PI3K-Akt活性的抑制进一步影响成骨细胞的增殖[43]；NF-κB与细胞的增殖、生长分化等密切相关[44]，也参与成骨细胞的分化及基因的表达[45]。

综上所述，在骨碎补治疗骨折的过程中，通过山奈酚、木犀草素等有效成分作用于IL6、EGFR、VEGFA等共同靶基因，通过前列腺癌通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路、TNF等信号通路调控类固醇激素受体、核受体、转录因子等受体活性发挥作用。本研究从微观水平上揭示了骨碎补促进骨折愈合的机理，这也符合中医理论中的整体观念。中药治疗疾病中是多成分、多靶点共同发挥作用，经过人体机能统一调控的结果。