以鸟苷为原料合成巴豆苷

孙莉萍，焦黎明，杨政楠，潘心，夏然，陈磊山

(1.新乡学院生命科学与基础医学学院，河南 新乡 453003；2.新乡学院药学院，河南 新乡 453003)

巴豆苷(Crotonoside)又称异鸟苷(CAS号1818-71-9)，是一种天然的核苷类化合物，最早从中药巴豆种子中分离得到。巴豆苷是巴豆重要的活性成分[1]。研究显示，巴豆苷具有多种生理活性，如能够增进肠道蠕动、降低血压，能够刺激大脑使AMP(腺苷酸)富集[2]，对小鼠S180腹水瘤和Ehrlich实体肿瘤都有显著的抑制作用[3]，可通过抑制FLT3和HDAC3/6在急性髓性白血病(AML)细胞中表现出选择性的后抑制作用[4]，可以通过调节兔心室肌细胞钠钙通道而具有抗心律失常作用[5]。另外，巴豆苷是生物体内RNA的结构片段鸟苷的异构体，可以作为鸟苷的类似物嵌入RNA片段中并进行基因表达，从而在生化研究中具有重要用途[6]。

目前，巴豆苷除了从天然资源中分离得到以外，化学合成法主要有以下3种路线：1)2-取代(I、Cl或NH2)腺苷经过光照水解[7]或重氮化反应[8]得到，但是选择性差，收率很低，或者2-羟基-6-硫取代嘌呤核苷经氨解得到[9]，但是原料合成难度大(图1，路线1)；2)异鸟嘌呤经硅醚保护后和基团保护的核糖在TMSOTf或SnCl4催化下缩合，再脱除保护基得到，缺点是步骤多，收率低，异鸟嘌呤的合成难度也很大[10](图1，路线2)；3)氨基咪唑甲酰胺核苷经环合仿生合成异鸟苷，但收率很低，不具有合成上的价值[11](图1，路线3)。以上3种反应路线限制了巴豆苷合成规模的扩大。从廉价易得的原料合成得到巴豆苷，可以避免从天然产物中分离、提取的繁琐步骤，扩大巴豆苷的来源；也可以解决现有化学合成方法中存在的收率低等问题。

图1 巴豆苷合成路线比较

鸟苷是核苷化学领域的基础原料，可以通过发酵法规模化生产，价格低[12]。笔者以鸟苷原料，经过乙酰化、氯代、重氮化、氨解同时脱除乙酰基等4步，得到巴豆苷，总收率62%。合成路线见图2。

图2 巴豆苷的合成路线

1 实验部分

1.1 原料与仪器

鸟苷，分析纯，新乡拓新药业股份有限公司；其他所用试剂均为市售分析纯。

XT4型显微熔点测定仪，温度计未校正，北京科仪电光仪器厂；AV 400型核磁共振仪(DMSO-d6或CDCl3为溶剂，TMS为内标，德国Bruker公司。

1.2 合成方法

1.2.1 2′，3′，5′-三-O-乙酰基鸟苷(3)

鸟苷(2，2.83 g，10 mmol)加入到乙腈(100 mL)中，再加入DMAP(N，N-二甲基吡啶，0.18 g，0.5 mmol)和三乙胺(6.23 mL，45 mmol)，搅拌30 min，冰水冷却，5 ℃下滴加醋酸酐(3.4 mL，36 mmol)，滴加完毕，转移至油浴锅，缓慢升温至60 ℃，持续反应2 h，TLC显示原料反应完全，加入甲醇(5 mL)，再继续反应30 min，冷却至室温，减压浓缩，有固体析出，过滤，水重结晶，得到白色固体0.388 g，收率95%。

白色固体，m.p. 231～233 ℃(文献[13]m.p. 231～233 ℃)。1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.73(s, 1H), 7.94(s, 1H), 6.54(brs, 2H), 6.00(d,J=6.0 Hz, 1H), 5.80(t,J=5.6 Hz, 1H), 5.03(t,J=5.6 Hz, 1H), 4.40～4.24(m, 3H), 2.12(s, 3H), 2.05(s, 3H), 2.04(s, 3H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δ 170.6, 169.96, 169.7, 157.1, 154.4, 151.6, 136.1, 117.3, 84.9, 80.0, 72.5, 70.8, 63.6, 21.0, 20.9, 20.7。

1.2.2 6-氯-2′，3′，5′-三-O-乙酰基鸟苷(4)

2′，3′，5′-三-O-乙酰基鸟苷(3，0.409 g，1 mmol)和N，N-二甲基苯胺(0.128 mL，1 mmol)溶于乙腈(10 mL)，室温搅拌30 min，加入氯化苄基三乙铵(0.332 g，2 mmol)，继续搅拌10 min，滴加POCl3(0.548 mL，6 mmol)，升温至回流，持续反应2 h，TLC显示原料反应完全，冷却至室温，倒入冰水中，搅拌，用CH2Cl2(10 mL×3)萃取，有机相用饱和NaHCO3溶液(10 mL)洗涤，活性炭脱色和无水Na2SO4干燥，过滤、减压浓缩后加入异丙醇(5 mL)，加热溶解，静置2 h，有固体析出，过滤，滤饼干燥后即得白色固体0.371 g，收率87%。

白色固体，m.p. 151～153 ℃(文献[13]m.p. 151～153 ℃)。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ 7.88(s, 1H), 6.02～5.95(m, 2H), 5.75(d,J=4.4 Hz, 1H), 5.30(brs, 2H), 4.47～4.35(m, 3H), 2.15(s, 3H), 2.11 (s, 3H), 2.09(s, 3H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δ 170.5, 169.6, 169.4, 159.1, 153.1, 151.9, 140.7, 125.8, 86.6, 80.0, 72.7, 70.5, 62.9, 20.7, 20.6, 20.4。

1.2.3 2-羟基6-氯-9-(2′，3′，5′-三-O-乙酰基)-β-D-呋喃核糖基嘌呤(5)

将4(0.428 g，1 mmol)加入到CHCl3(9 mL)中，搅拌溶解，加入H2O(1 mL)，室温滴加亚硝酸异戊酯(0.403 mL，3 mmol)，升温到60 ℃，继续反应2 h，TLC显示反应完全，减压浓缩，柱层析分离[流动相V(氯仿)∶V(甲醇)=9∶1]，得到白色固体0.346 g，收率81%。

白色固体，m.p. 132～133 ℃(文献[14]m.p. 131～133℃)。1H NMR(CDCl3, 400 MHz) δ 10.80(s, 1H), 7.95(s, 1H), 6.18(d,J=5.6 Hz, 1H), 5.92(t,J=5.6 Hz, 1H), 5.66(t,J=4.8 Hz, 1H), 4.45～4.33(m, 3H), 2.12(s, 3H), 2.09(s, 3H), 2.06(s, 3H);13C NMR(CDCl3, 100 MHz) δ 170.3, 169.6, 169.4, 155.6, 153.0, 149.7, 138.9, 120.1, 86.3, 80.3, 73.2, 70.7, 63.1, 20.7, 20.5, 20.4。

1.2.4 巴豆苷(1)

将5(0.428 g，1 mmol)和饱和的NH3/CH3OH溶液(10 mL)加入到密封反应管中，加热到50 ℃反应12 h，冷至室温，释放压力，反应液真空浓缩，水重结晶，得到白色固体10.263 g，收率93%。

白色固体，m.p. 238～240 ℃(文献[15]m.p. 238～240 ℃)。1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.88(s, 1H), 8.37(s, 1H), 7.83(brs, 2H), 5.81(d,J=6.0 Hz, 1H), 5.47(d,J=6.0 Hz, 1H), 5.19(d,J=4.8 Hz, 1H), 5.05(t,J=4.8 Hz, 1H), 4.52～4.48(m, 1H), 4.12～4.09(m, 1H), 3.93 (d,J=3.6 Hz, 1H), 3.67～3.52 (m, 2H);13C NMR(DMSO-d6, 100 MHz) δ 160.2, 156.0, 151.6, 137.1, 112.4, 84.1, 83.3, 75.6, 61.1。

2 结果与讨论

2.1 合成路线优化

合成得到中间体4之后，除了图2所示的路线，理论上也可以先氨解得到2-氨基腺苷(6)，然后发生重氮化反应。但是，这条路线的收率只有32%，并且重氮化反应选择性差，还会有鸟苷(2)等副产物的产生。

2.1.1 2-氨基腺苷(6)合成

将化合物4(0.428 g，1 mmol)和饱和的NH3/CH3OH溶液(50 mL)加入到密封反应管中，加热到50 ℃反应12 h，冷至室温，释放压力，反应液真空浓缩，水重结晶，得到白色固体60.239 g，收率85%。

白色固体，m.p. 235～237 ℃(文献[15]m.p. 235～237 ℃)。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 7.93 (s, 1H), 6.79 (brs, 2H), 5.74 (brs, 2H), 5.73 (s, 1H), 5.45 (t,J=4.8 Hz, 1H), 5.37 (d,J=6.4 Hz, 1H), 5.10 (d,J=4.4 Hz, 1H), 4.55 (q,J=6.0 Hz, 1H), 4.13 (q,J=4.0 Hz, 1H), 3.93 (d,J=2.8 Hz, 1H), 3.68～3.64 (m, 1H), 3.58～3.52 (m, 1H);13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 160.5, 156.7, 151.9, 136.8, 114.1, 87.6, 86.0, 73.7, 71.2, 62.2。

2.1.2 重氮化法合成巴豆苷(1)

化合物6(0.282 g，1 mmol)加入到H2O(10 mL)中，再加入NaNO2(0.24 g，3.5 mmol)，搅拌溶解，滴加AcOH(0.27 mL，6.9 mmol)，升温到50 ℃反应1 h，反应完毕，降至室温，用氢氧化钠溶液中和，减压浓缩，水重结晶，得到的固体柱层析分离，得到巴豆苷和鸟苷，收率分别为32%和21%。

鸟苷(2)：白色固体，m.p. 238～240 ℃(文献[16]m.p. 238～240 ℃)。1H NMR (DMSO-d6, 400 MHz) δ 10.65 (s, 1H), 7.94 (brs, 1H), 6.45 (brs, 2H), 5.71 (d,J=6.4 Hz, 1H), 5.39 (d,J=6.0 Hz, 1H), 5.11 (d,J=4.8 Hz, 1H), 5.03 (t,J=5.2 Hz, 1H), 4.43 (q,J=5.6 Hz, 1H), 4.11 (q,J=4.4 Hz, 1H), 3.90 (q,J=4.4 Hz, 1H), 3.65-3.60 (m, 1H), 3.56～3.51 (m, 1H);13C NMR (DMSO-d6, 100 MHz) δ 157.2, 154.1, 151.8, 136.1, 117.2, 86.8, 85.7, 74.2, 70.8, 61.9。

2.2 2-羟基9-(2′，3′，5′-三-O-乙酰基)-β-D-呋喃核糖基嘌呤(5)合成条件优化

嘌呤环外氨基参与重氮化活性较低，其重氮化反应直接影响2位羟基的引入，是整条合成路线的关键步骤。对重氮化反应的关键条件重氮化试剂、溶剂、反应温度等进行了优化，结果见表1。结果表明，以水溶剂，以NaNO2/醋酸为重氮化试剂，在室温条件下反应4 h，无反应发生。提高温度至50 ℃，收率17%。溶剂中加入吡啶或氯仿作为混合溶剂，收率稍有提高，分别达到20%和33%。随后，对重氮化试剂进行了筛选。亚硝酸叔丁酯收率高于NaNO2/醋酸，6 mmol的亚硝酸叔丁酯可以得到60%的收率。当把亚硝酸叔丁酯改变为亚硝酸异戊酯时，收率提高到68%。随着温度的升高，收率提高，60 ℃时收率基本不再增加，达到72%。延长反应时间至6 h，收率78%。综上，合成6的优化条件为：6 mmol亚硝酸异戊酯，CHCl3/H2O为混合溶剂，60 ℃反应6 h，收率81%。

表1 2-羟基6-氯-9-(2′，3′，5′-三-O-乙酰基)-β-D-呋喃核糖基嘌呤(5)合成条件优化

2.3 关键反应步骤反应规模对反应的影响

为了增加该反应的实用性，考察了关键步骤氨解和重氮化的反应规模对收率的影响(表2)。结果显示，在适当延长反应时间后，氨解步骤可以扩大到200 g，重氮化步骤可以扩大到100 g，收率没有下降，分离纯化不需柱层析，操作及后处理均非常简便。

表2 不同反应规模对收率的影响

由表2可知，在反应规模达到200 g时，经过常规的分离提纯后，氨解收率可以达到88%。在反应规模达到100 g时，重氮化步骤的收率可以达到78%。对母液回收利用，收率还会有所增加，所以，总体上整条路线的收率高，分离纯化简便，具有一定的应用性。但是重氮化步骤尽管没有中间产物重氮类化合物的分离，降低了爆炸性危险系数，但是在反应规模扩大以后仍然具有一定的危险，这也是本方法的局限性所在。

3 结 论

以鸟苷为原料，用乙酰基保护糖环上的羟基，再和POCl3反应，将6位羰基转化为氯原子，继而在亚硝酸异戊酯作用下发生重氮化反应，将2位氨基转化为羟基，最后在饱和的NH3/CH3OH溶液中将6位氯原子氨解转化为氨基，同时脱除乙酰基，以4步和62%的总收率得到巴豆苷。该方法原料廉价易得，解决了传统方法中原料价格高的问题，产物成本低，高效、简便，易于扩大生产，反应规模可以扩大到200 g，收率基本没有降低，具有一定的应用前景。