健神利水方对脑出血大鼠水通道蛋白AQP-4表达的影响

高玉广 黄德庆 刘 泰 何乾超 刘永辉 莫穷泽 张元侃 邓海霞 黄树武

广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023

血脑屏障，主要由脑微血管内皮细胞、基底膜和星形胶质细胞构成，存在于脑组织和血液之间的屏障结构。脑出血患者发生血脑屏障功能异常，内环境紊乱，血液中的多种物质进入大脑，侵袭大脑组织，血肿周围水肿在3小时到7天内可持续增加，是脑出血后的重要病理改变[1-3]。因此，保护血脑屏障功能在脑出血治疗中尤为重要。水通道蛋白(Aquaporin, AQP)是疏水性蛋白，其中水通道蛋白4(AQP-4)是脑组织内最重要的水通道蛋白，可维持脑内水平衡。脑组织里的AQP-4大多数存在于血脑屏障的星形胶质细胞膜表面，其介导水进出脑组织。血脑屏障破坏后，AQP-4表达异常，脑组织水代谢障碍，引起脑水肿[4-5]。研究[6]表明caveolin-1在脑出血后的表达发生了上调，认为caveolin-1在脑出血早期的脑损伤中发挥的是破坏性的角色，前期研究表明，健神利水方可以减少实验性脑出血大鼠caveolin-1表达[7-8]，可以减少脑出血大鼠神经功能损害及脑含水量[9]，为了深入研究，本课题拟通过动物实验，采用胶原酶制作脑出血大鼠模型，模拟脑出血发展过程，观察脑含水量和AQP-4表达水平，同时观察健神利水方对脑出血大鼠AQP-4表达的影响，探讨健神利水方治疗脑出血分子机制；为脑出血的治疗靶点提供证据，为中医药治疗脑出血提供科学依据，具体汇报如下。

1 资料与方法

1.1 动物及实验材料 实验动物：清洁级健康20月龄雌性SPF级大鼠160只，采购来源于长沙市天勤生物技术有限公司(许可证号：SCXK湘2019-001)。主要实验试剂及药物：AQP-4抗体(Abcam，lot:ab128906),Western blotting 一抗稀释液(biosharp，lot:70015829)，胶原蛋白酶(美国Sigma公司，lot#50190619)，内参Anti(biosharp，lot:69070015)，ECL化学发光试剂盒(biosharp，lot:69070015，BL523A)，SDS-PAGE蛋白上样缓冲液5X(biosharp，lot:69078121c)。健神利水方组方(丹参15 g、茯苓15 g、三七粉3 g、猪苓15 g、泽泻10 g、白术10 g、桂枝6 g)[一方药业有限公司]。实验器械：脑立体定位仪(成都仪器厂，ST-4ND)，5 μL、100 μL微量注射器，电子分析天平(奥豪斯仪器常州有限公司，型号AR224CN)，组织研磨仪(武汉赛维尔生物科技有限公司，型号：KZ-III-F)，发光凝胶成像仪(美国 Alpha公司，型号：fluorChem E)

1.2 研究方法

1.2.1 脑出血大鼠模型 脑出血模型：大鼠术前4 h禁水、禁食，采用10%水合氯醛(10 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，将大鼠放置于立体定位仪上，保证前囟和后囟在同一水平面，按照Gary等[10]的造模方法，于前囟后1 mm，右侧 3 mm 处(即为右侧尾状核的位置)钻一直径约1 mm 的小孔，使用立体定位仪上的微量注射器进针6 mm，在 10 min 内注射胶原酶Ⅶ0.5 U，注射结束后停针 5 min，缓慢退针。

脑出血模型建立成功的评价：参照Matsushita等的研究[11]，对苏醒后的大鼠进行动物行为学评定(4分——不能行走；3分——偏向对侧倾倒；2分——向瘫痪侧转圈；1分——不能完全伸展对侧前爪；0分——无神经损伤症状)，功能≥2 分的动物表示造模成功，入选本实验，<2分的被剔除，并补充实验动物，达到各组所需的总数量。

假手术模型：以等量生理盐水代替胶原酶，建立方法同胶原酶脑出血模型。

1.2.2 分组及造模 实验动物和分组：以人60岁为老年年龄，大鼠对应鼠龄则为20个月，取160只取20～22月龄成年雄性SD大鼠，体重300±35 g，分别两次采用SPSS18.0产生随机序列。第一次随机分出空白组(n=40，不予任何处理)、假手术组(n=40，注射等剂量生理盐水)以及脑出血组(n=80，注射胶原酶制备脑出血模型)，在脑出血模型建立后再次分别进行随机分组：A：模型组，B：健神利水组，每组40只，以避免分组后再进行造模，从而增加偏倚的风险。

1.2.3 干预方法 造模后，空白组仍不予任何处理，假手术组予生理盐水灌胃，模型组予生理盐水灌胃，健神利水组给予健神利水方灌胃，临用按《现代医学实验动物学》进行换算，每次按380 mg/kg配成新鲜灌胃液，每日2次，持续7 d。

1.2.4 取材及处理 取相应时间点6 h、24 h、3 d、7 d的大鼠，麻醉后，开胸，将钝头灌注针沿心尖插入主动脉，用止血钳固定针头，剪开心耳后，用生理盐水快速灌注冲洗，持续到流出没有血水的液体、大鼠上肢苍白为止，随后换4%多聚甲醛溶液进行心脏灌注固定，固定时多聚甲醛溶液的速度先快后慢，直至大鼠僵硬如板状，打开颅腔迅速取脑，再根据免疫印迹法检测要求而制作相应标本以供保存。

1.3 观察指标

1.3.1 脑组织含水量测定 麻醉大鼠，断头处死，迅速取出脑组织，立即称湿重。将组织放入烘干箱100烘烤24 h再称干重。按Elliot公式计算脑组织水含量：脑组织水含量(%)=(湿重-干重)/湿重×100%。

1.3.2 免疫印迹(Western blot)检测AQP-4的表达水平 脑组织置 0.5 mL 印迹缓冲液。超声波匀浆，置于1.5 mL离心管中，电动组织研磨棒进行组织研磨，进入蛋白裂解液，裂解5分钟后于4 ℃，1000 rpm，离心10 min，去沉淀组织，留取上清液。测出各样本的蛋白质浓度。然后电泳，分离胶浓度8%，每泳道加入50 μg蛋白样品。待溴酚蓝到达分离胶底部后，进行转膜。转膜完成后，将PVDF膜后置于含5%脱脂奶封闭液室温封闭1小时，加入一抗，4 ℃孵育过夜。次日用WB洗涤液洗PVDF膜3次后，加入二抗，室温孵育1 h。WB洗涤液洗PVDF膜3次后加入3 mL化学发光溶液(ECL)，随即进行光敏胶片显像。用Imag J图像分析系统测定蛋白信号的灰度值，β-Actin作为内参蛋白并对蛋白相对表达量进行统一处理。

1.4 统计学方法 使用统计软件MedCalc15.2.2进行统计分析，正态分布的计量资料，两组组间比较，采用t检验，三组组间比较采用方差分析；非正态分布计量资料组间比较采用非参数法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 研究结果

2.1 各组脑组织含水量比较 空白组、假手术组未出现脑组织含水量变化，其余各组脑组织含水量从6 h时起均逐渐增多；模型组和健神利水组于3 d时脑组织含水量达到顶峰。健神利水组6 h、24 h、3 d、7 d时间点脑组织含水量均低于模型组(P<0.05)。详细见表1、图1。

表1 各组大鼠脑组织含水量比较

图1 各组大鼠脑组织含水量比较

2.2 各组AQP-4的表达水平比较 空白组、假手术组未出现AQP-4上调，其余各组AQP-4从6 h时均逐渐增高上调；模型组和健神利水组于3 d时AQP-4表达值达到顶峰。健神利水组6 h、24 h、3 d、7 d时间点AQP-4表达低于模型组(P<0.05)。详细见表2、图2、图3。

表2 各组大鼠各个时间点AQP-4表达

图2 各组AQP-4不同时间点表达趋势图 图3 各组AQP-4各时间点表达图

3 讨论

脑出血是常见的脑血管疾病，常由高血压所致，脑出血常伴随出现原发性血肿，预后的康复治疗往往与血肿大小及位置相关，同时脑出血并有脑水肿出现[12]。脑出血属于中医领域的“中风”范畴，Front Pharmacol以及Chin J Integr Med杂志刊登的两项研究[13-14]表明，中药通过多靶点、多途径的方式治疗脑出血，改善脑出血的症状。广西名中医刘泰教授等基于祖国医学理论、动物实验、临床研究结论，认为脑出血主要机制关键为 “脑内蓄血”及“瘀水内阻”引起脑失其司知觉，出现偏瘫、失语，健神利水方是由经方五苓散加三七、丹参化裁而成，该方以君药泽泻之甘淡直达肾与膀胱之所，利水渗湿；臣药茯苓、猪苓之淡渗助泽泻增强利水渗湿之功；佐药白术、茯苓健脾利水；加三七通脉行瘀，止血不留瘀，丹参养血活血，改善脑循环，具有温阳化气、利水行瘀的作用，适用于脑出血伴脑水肿患者[7，9]。

AQP-4的表达在脑部水肿区的明显增多，因此Previch LE等[4-5]认为上调的AQP-4参与了脑水肿的形成。本项目研究结果显示，实验性大鼠在脑出血后脑含水量不断升高(6 h至3 d时间段)，而此时间段的AQP-4的表达也随着脑含水量的升高而升高，AQP-4表达值与脑含水量成正相关的关系，也与Previch LE的研究结果相一致，脑水肿发生与AQP-4密切相关。健神利水方可以减少脑出血大鼠神经功能损害及脑含水量，在本实验研究中，健神利水组的各个时间点的脑组织含水量低于模型组，与此同时，健神利水组各个时间点的AQP-4表达低于模型组，可以得出结论：健神利水方可以减少脑出血大鼠脑组织含水量，可抑制AQP-4表达。

AQP-4表达值与脑含水量关系密切，原因在于脑组织的AQP-4主要分布于血脑屏障，当脑出血发生后，血脑屏障受损，内环境发生紊乱，血肿AQP-4大量聚集，周围产生炎性水液，水通道异常，引起脑水肿，是脑出血后的重要病理基础[15-16]。本实验研究表明：脑出血后，脑组织含水量增多，AQP-4表达增多；健神利水方可以减少脑出血大鼠脑组织含水量，可抑制AQP-4表达，一方面揭示了脑出血相关的分子机制，另一方面也为健神利水方治疗脑出血提供了实验依据。