RAB10在人肝癌组织中的表达及对患者预后的影响*

杨大业 唐世磊 李宏武

中国医科大学附属第四医院 (辽宁 沈阳, 110032)

原发性肝癌(肝癌)是临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一，具有起病隐匿、进展快、恶性程度高、生存期短等特点。全球每年新发的原发性肝癌病例约为78万例，死亡约74万例,其中超过一半发生在我国[1,2]，手术、放化疗虽能在一定程度上改善肝癌患者的预后,但许多患者在确诊时就已经失去了最佳治疗时机。因此，研究肝癌发生、发展的分子学机制将有助于探寻肝癌的早期诊断与治疗的新靶点。

自噬是细胞通过溶酶体或液泡分解自身组分,以达到维持细胞内正常生理活动和稳态的一种细胞代谢过程[3]。研究表明,自噬与肿瘤的发生发展有着紧密的联系。在肿瘤的发生发展过程中能够通过降解细胞器和蛋白质等为肿瘤细胞提供生长所需[4]。肿瘤的存活与增殖可能通过自噬调节肿瘤与肿瘤微环境因素的相互关系来实现。因此,通过促进或者抑制自噬从而治疗肿瘤,已经成为攻克肿瘤的新思路[5]。

由于RABs在介导肿瘤自噬及肿瘤发生发展过程中发挥重要作用,因此关于RABs在肿瘤发生发展过程中的作用已经成为研究的热点。本实验通过蛋白免疫印迹技术(Western Blot)检测 RAB10蛋白在肝癌组织及正常肝组织中的表达情况,并对RAB10的表达差异与肝癌患者临床病理资料进行相关性分析，以初步探讨RAB10在肝癌组织中表达的意义以及可能的作用调控机制。

1 资料与方法

1.1 人体组织标本 65例人肝癌组织及其配对正常肝组织由2012年1月至2015年1月于中国医科大学肿瘤医院确诊为肝癌经手术治疗并经患者签署知情同意书后取得。所有患者术前均未接受化疗及放疗。65例中,男46例,女19例;年龄33～78岁,中位年龄62岁,其中40例≤60岁,25例>60岁;肿瘤直径≤3 cm 37例,>3 cm 28例;术中或术后病理提示有淋巴结 转移癌者20例,无淋巴结转移癌者45例。按国际抗癌联盟(UICC)分期标准[6]进行分期：Ⅰ期+Ⅱ期39例,Ⅲ期+Ⅳ期26例。取肝癌标本同时取正常肝组织标本(距离肿瘤>2 cm) 作为对照。肝癌组织及正常组织标本切除后立即应用液氮冷冻储存以供蛋白提取以及免疫印迹实验(Westernblot)。组织病理学评估均由两位高年资病理医生独立观察, 确诊为肝细胞癌并复查无误。所有标本检测均经患者及其家属同意,并签署知情同意书。

1.2 Western Blot实验 取蛋白样品30 μg放0.5 ml Ep管内，加入5×SDS上样缓冲液至终浓度为1×，混匀后于沸水煮沸5 min使蛋白变性。取蛋白上样进行SDS-PAGE,以内参GAPHDH作为蛋白上样量标准品。配置10%分离胶和4%浓缩胶进行电泳。恒压100 V，120 min。转膜结束后，小心取出膜至干净的玻璃瓶皿内，以TBST缓冲液(20 mmol/L Tris-HCl,150 mmol/L NaCl和0.05%Tween 20)洗5 min×3次，用含50 g/L脱脂奶粉的TBST缓冲液4度封闭过夜。弃去封闭液，TBST洗5 min×3次，加入抗RAB10多克隆抗体(1∶1 000，Abcom公司)，抗GAPDH 多克隆抗体(1∶2 000,Sigma公司),置4℃过夜。TBST摇床清洗5 min×5次,最后加入HRP标记的相应二抗,采用底物增强化学发光ECL法显色,并利用软件Quantity One(BIO-RAD 公司)进行灰度分析。

1.3 TCGA数据库 通过GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)获取TCGA数据库中RAB10在肝癌组织与正常肝脏组织中的表达数据并分析RAB10的表达与无病生存期(DFS)、总生存期(OS)的关系[7]。此外，我们通过基因表达的相关性分析，分析自噬相关基因(ATG)家族成员在肝癌中与RAB10表达的相关性，筛选出与RAB10高表达明显相关的ATG蛋白。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0统计软件和GEPIA生存分析功能。RAB10表达水平与各临床病理参数关系分析采用χ2检验;RAB10表达与肝癌患者OS、DFS之间的关系采用Kaplan-Meier法分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RAB10蛋白在人肝癌组织和正常肝脏组织中的表达水平测定 Western Blot结果显示, RAB10蛋白在人肝癌和对应的正常肝脏组织中均有表达,但在肝癌中的相对表达水平高于正常组织,见图 1。

2.2 RAB10的表达与肝癌患者临床病理参数的相关性分析 根据Western Blot结果显示的RAB10在肝癌中的表达情况,65例肝癌患者分为两组:RAB10高表达组(n=35)和低RAB10表达组(n=30)。表1所示高RAB10表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期显著相关(P<0.05),而与年龄、性别无相关性。

图1 RAB10蛋白在肝癌组织和正常肝组织中的表达图

表1 肝癌组织中RAB10的表达与患者临床病理参数的关系

2.3 RAB10的表达与肝癌患者生存时间的关系 使用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)获取TCGA数据库中肝癌患者的表达数据并分析RAB10的表达对患者OS、DFS的影响。图2显示, RAB10在不同分期肝癌中相对表达量存在显著差异(P<0.001)，RAB10的表达量越多，肿瘤分期越高。更重要的是,RAB10高表达患者的OS和DFS显著低于RAB10低表达者,差异具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),见图3。

图2 RAB10在不同分期肝癌中相对表达量图

图3 不同RAB10表达水平的肝癌患者的OS及DFS

2.4 RAB10的表达与ATG表达的相关性 在肝癌组织中，RAB10的高表达与ATG3、ATG5、ATG6、ATG7的高表达呈明显的正相关(P<0.001)。相关系数分别为0.7、0.61、0.6、0.63，其中RAB10的高表达与ATG3的表达情况相关性最强，见图4。

图4 RAB10的表达与ATG3、ATG5、ATG6、ATG7表达的相关性

3 讨论

RAB10属于小型RabGTPase的一种，它作为Ras超家族单体G蛋白的一部分,以在膜转运活动中担任主配位体而被人熟知[8]。近来研究发现，RAB10可参与细胞成分物质运输、内吞循环、内质网小管形态及动力调节等自噬过程[9-11]，尤其在脂质吞噬(脂噬)中发挥活跃作用[12]。近来关于RAB10在恶性肿瘤中的表达情况已有相关报道，RAB10在肝癌、骨肉瘤、食管鳞癌等恶性肿瘤中可促进肿瘤的增殖和侵袭，这种效应可被microRNA抑制[13-15]。因此，RAB10与肿瘤的发生发展关系密切。

本研究选择了配对的65例肝癌组织和正常肝组织作为研究对象，结果显示,RAB10蛋白在肝癌组织中的表达显著高于正常肝组织(P<0.05),这说明RAB10蛋白的表达与肝癌关系密切。结合TCGA数据库的182对肝癌患者RAB10的表达情况对患者OS、DFS的影响来看，RAB10在肝癌组织中的表达显著高于正常肝组织,且RAB10在不同分期肝癌中相对表达量存在显著差异，分期越高，RAB10的相对表达量也越高，因此RAB10可能参与肝癌异型性的调控。这似乎提示RAB10在肝癌中的高表达可促进恶性细胞的侵袭转移,其表达增加时肝癌更易于复发转移，从而导致预后不良。

鉴于RAB10在肿瘤自噬，尤其是脂噬过程中发挥的重要作用，我们通过TCGA数据库筛选了肝癌中与RAB10表达明显相关的ATG。结果发现，RAB10与ATG3、ATG5、ATG6、ATG7表达呈明显的正相关，其中与ATG3最相关(R=0.7)，这说明RAB10与ATG之间可能存在某种关系的调控机制，这有待于严谨的细胞学实验研究来验证和丰富。