两种HBV DNA荧光定量PCR检测试剂的检测能力精度比较

巫智勇 叶 英

安徽省合肥市安徽医科大学第一附属医院 (安徽 合肥， 230032)

乙型肝炎病毒(HBV)感染是我国极为重要的公共卫生问题。HBV DNA的复制是乙肝病情进展的主要原因，采用PCR方法定量检测HBV DNA对慢性乙型肝炎的诊断、治疗和预后判断具有重要意义[1]。Cobas系统是Roche公司研制的用于核酸检测的实时荧光定量PCR方法，其检测的下限可达到20 IU/ml，上限为1.7×108IU/ml，定量线性范围较广。2007年美国即推荐使用Cobas试剂作为HBV DNA检测的方法，然而这种国际公认的HBV DNA精准定量的检测方法，由于其试剂价格昂贵，且必须采用Roche公司专用PCR仪，故在我国难以广泛使用。目前国内大多采用国产试剂检测HBV DNA，国产试剂的检测下限一般均为1 000 copy/ml。在临床实践中发现，病毒低水平复制与疾病进展关系密切。慢乙肝患者经过长期抗病毒治疗，血清中HBV没有<20 IU/ml时，会导致肝脏疾病继续进展，甚至发生HCC[2]。Choi等[3]研究进一步证明了核苷类药物治疗必须将血清DNA降得越低越好。本研究对未经和已经进行核苷类药物抗病毒治疗的乙型肝炎患者，进行了Cobas和国产试剂的同步检测，以了解两者检测精度的差异，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 血清标本 先后收集安徽医科大学一附院2019年3月至2019年6月期间门诊和住院的未经和已经进行核苷类药物治疗的慢性乙型肝炎或乙型肝炎肝硬化患者血清70份，所有患者均符合中华医学会肝病学分会、感染病学分会制定的2019版《慢性乙型肝炎防治指南》的诊断标准[4]。标本均系空腹采取，2小时内分离血清并置于-20℃低温冰箱保存。

1.2 HBV DNA定量检测 HBV DNA分别用Cobas定量试剂(Roche)和上海之江生物科技股份有限公司试剂(ZJ)进行检测。所有试剂均有正式批文，批检合格并在有效期内使用，扩增反应分别在Cobas TaqMan 48 PCR仪和美国Applied Biosystem公司生产的ABI 7500基因扩增仪进行。同一份标本采用2种试剂进行平行检测，具体操作和结果判定参照试剂盒说明进行。Roche结果电脑自动设置的单位为IU/ml，ZJ试剂单位为copy/ml，为便于比较，根据Roche的换算值：1 IU/ml=5.83 copy/ml，将单位为IU/ml的结果换算为copy/ml为单位，如20 IU/ml=116 copy/ml。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.5统计软件。数据分析采用t检验、相关分析和χ2检验。检验水准为0.05。

2 结果

2.1 采用Roche试剂对70份标本的检测结果 70份标本进行Roche HBV DNA检测，其中处于Roche检测下限(≤116 copy/ml)的标本有17份，大于Roche检测上限(≥9.91×108copy/ml)的标本有6份，余下的47份均检测出具体的HBV载量，病毒载量在102～103，103～104，104～105，105～106，107～108，108～大于9.91×108(copy/ml)范围内的标本数分别为：10，9，6，9，5，6，2份。

2.2 采用国产ZJ试剂对70份标本的检测结果 处于检测下限(≤1 000 copy/ml)的有43份，余下的27份均检测出具体的HBV载量，其中病毒载量在103～104，104～105，105～106，107～108，108～109，109以上(copy/ml)范围内的标本数分别为：3，5，3，6，6，3，1份。

2.3 ZJ检测结果与Roche检测结果的相关性分析 由于处于ZJ检测下限的标本有43份，处于Roche检测下限的标本有17份，大于Roche检测上限的标本有6份，这些结果没有具体的数值，不适合做相关性分析，因此只对其中20份两种检测方法均有具体数值的进行相关性分析。ZJ试剂检测结果与Roche检测结果的总体相关系数r=0.612，P=0.004，说明两者之间存在显著的线性相关(见图1表示的散点图)。将标本按照病毒载量分级，在病毒载量分别为103～104，104～105，105～106，106～107，107～108，108～109(copy/ml)范围内的标本中，国产ZJ试剂检测结果与Roche定量结果的相关性分别为：-0.081，0.311，-0.081，0.311，0.271，0.387，检测P值分别为：0.504，0.009，0.504，0.009，0.023，0.001。再按照以下5个范围内的病毒载量分级：103～104，103～105，103～106，103～107，103～108(copy/ml)，国产ZJ试剂检测结果与Roche定量结果的相关性分别为：-0.129，0.107，0.13，0.304，0.295，检测P值分别为：0.287，0.378，0.283，0.011，0.013，可见在103107copy/ml范围以上，两种检验方法间存在显著的线性相关。

图1 Roche试剂检测结果与ZJ试剂检测结果的相关性分析(r=0.612，P=0.004)

2.4 ZJ试剂检测结果低于检测下限的与Roche检测结果的比较 采用ZJ试剂检测结果阴性(低于检测下限)的标本有43份，应用Roche定量检测结果分别为：处于检测下限(≤116 copy/ml)的标本有17份，占39.5%；处于102～103的标本有10份，占23.3%；处于103～104的标本有9份，占20.9%；处于104～105的标本有2份，占4.7%；处于105～106范围内的标本有5份，占11.6%。共26份(60.5%)的病毒载量在106 copy/ml 范围的标本ZJ检测为低于检测下限，ZJ试剂检测结果低于检测下限的与Roche检测结果的比较如图2所示。ZJ试剂检测结果≤1 000 copy/ml而Roche检测结果>1 000 copy/ml的，即ZJ试剂检测结果呈假阴性的标本有16例，占37.2%。

图2 国产HBV DNA阴性患者43例采用罗氏HBV DNA检测分布图

3 讨论

对全部标本的检测结果进行相关性比较，结果显示，ZJ试剂与Roche试剂具有较好的相关性(r=0.612，P=0.004)，表明国产试剂总体来说反映了标本中的病毒载量水平，可以用于常规检测。将检测结果按不同HBV DNA拷贝水平进行分组分析，发现ZJ试剂仅与病毒载量在107copy/ml以上的标本具有较好的相关性，而病毒载量低于≤106copy/ml范围内的标本相关性差，没有统计学意义，这与薛艳等报道相似[5，6]。国产试剂对于病毒载量低于106copy/ml 的标本检测结果的问题突出体现在三个方面：①检测结果准确性差；②相当比例的标本国产试剂出现检测值≤1 000 copy/ml，病毒载量越低，出现检测值低于下限值的比例越高。本研究中国产试剂检测结果阴性的标本有43份，而Roche检测真正检测不到的标本仅17份(39.5%)，余下的标本26份(60.5%)均检测到病毒载量，波动范围为在102～106copy/ml，其中，在病毒载量处于102～104copy/ml的标本有19份，占44.2%；③病毒载量低于106copy/ml的标本，国产试剂检测结果的重复性差，同一标本不同批次的检测结果可以相差1个数量级。上述缺点，使得ZJ试剂对于接受抗病毒治疗后的个体由于体内病毒载量处于低水平而不能准确的监测，从而不能帮助医生准确判断乙肝抗病毒治疗的关键时间点如第24周或48周的疗效，以及在长期抗病毒治疗中不能够将病毒降到越低越好从而减少肝癌发生的要求。2019年慢性乙型肝炎防治指南指出，只要HBV DNA阳性，不论载量高低，合并有肝脏损伤时，就需立即抗病毒治疗[4]。部分患者由于国产试剂检测结果的精度问题，延误了治疗而出现病情进展。

本研究发现ZJ试剂检测结果≤1 000 copy/ml而Roche检测结果>1 000 copy/ml的标本有16份，占ZJ试剂检测结果呈阴性的43份标本的37.2%。这种假阴性的发生可能是病毒变异或不同基因型的病毒感染造成的特异性引物或探针结合区不能有效结合，无法水解探针激发荧光有关，鉴别这种假阴性可以参考HBV血清学和肝功能检测结果，或进行HBV DNA复测。若无Roche检测，则通过应用国内不同厂家(主要是引物和探针不同)的试剂进行平行检测而确定[7，8]。ZJ试剂检测结果呈阴性而Roche检测结果处于102～103copy/ml的有10份，占ZJ试剂检测结果呈阴性的43份标本的23.3%，这种假阴性的发生可能与Roche检测病毒载量在103copy/ml 以上的标本的假阴性不完全相同，这主要因Cobas TaqMan Amplicor系统有以下两个特性：①在引物和探针设计上，选择适合所有不同基因型HBV的检测；②设立内部标准品(QS)的管内质控，一方面用于定量，另一方面监控PCR反应的进程。QS是已知拷贝数的人工构建核酸，与靶核酸序列相同，加入每一个样本中，与样本一同提取、扩增，根据标准品的扩增曲线对靶核酸进行定量，与国产试剂采用的传统外标法定量相比，内标法完全消除由于核酸提取、扩增效率不同而造成的管间差异，定量结果更准确可靠，而且QS参与从核酸提取到荧光定量PCR整个实验流程，可避免由于反应抑制造成的假阴性结果，也避免了溶血、脂血和黄疸等对PCR结果的干扰。基于这些特性，Cobas系统是精准度最高的病毒检测仪，成为国际上检测HBV DNA 的金标准。

根据以上研究结果，建议对于HBV DNA低于106copy/ml的标本，尤其是经过抗病毒治疗后国产检测低于检测下限的，应采用Cobas高精度病毒载量检测系统进行检测或复测，避免假阴性结果而延误病情，从而让患者得到更有效、更有价值的治疗，提高肝炎患者的治疗效果和生活质量。