红景天苷调控PI3K/Akt信号通路对永久性脑缺血大鼠的保护作用

黄嘉慧，赵春蕊，聂婧雯，罗 锐，黄私迎，孙春晓，杨泽霖，应 雄，洪桂祝，赖文芳

(福建中医药大学药学院，福建 福州 350122)

脑卒中作为世界死亡和伤残对第二原因，具有高死亡率、致残率和发病率。因中风伤残或死亡的人从1990年到2016年翻了一倍，每年新增病例有1 300多万人。早在2017年龄标准化中风就超过了心脏病，肺癌等其他疾病成为了中国年龄标准化死亡原因的榜首[1-2]。由于多种因素导致局部脑组织血供减少或完全中断，脑卒中导致局灶性组织梗死及相应的突发性神经功能缺损多急性缺血性脑卒中占中国脑卒中的69.6%-70.8%[3-4]。然而幸存者仍然有着极高的致残风险，需要短期或长期的康复，造成了巨大的人力和经济负担[5]。

红景天为我国传统中草药，有益气活血，通脉平喘之功效，其中，红景天苷( salidroside,Sal) 是红景天的主要有效成分，具有增强记忆、改善心脑血管系统功能等多种药理作用[6]。本团队致力于红景天苷药物研发，前期研究发现，红景天苷对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤(tMCAO)的神经保护作用及其机制，阐明红景天苷能够降低梗死面积，修复神经功能损伤，对tMCAO大鼠具有神经保护作用[7-13]。由于新药的研发在临床前药效学研究阶段,需要两种以上动物模型的研究，课题组也研究了红景天苷对永久性脑缺血(pMCAO)大鼠的作用，并明确红景天苷能够降低pMCAO大鼠脑梗死体积[8]，但对pMCAO大鼠作用的具体机制尚不明确，因此，本文将进一步探索红景天苷对pMCAO大鼠的神经保护机制。

1 材料与仪器

1.1 实验动物70只SPF级雄性SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司购入)，体质量(220±20)g，按照SPF级规范，恒定湿度和温度，不禁食，不禁水，适应性饲养(福建中医药大学实验动物中心饲养)。上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号：2015000509563，许可证号：SCXK(沪)2015-0002；福建中医药大学实验动物中心许可证号：SYXK(闽)2015-0005。

1.2 药品与主要试剂红景天苷(福建中医药大学，纯度98%)；β-actin抗体(货号：H015)，来自碧云天生物技术有限公司；FITC标记羊抗鼠IgG(货号：ab7064)、TRITC标记羊抗兔IgG(货号：ab6718)、NeuN抗体(货号：AB51005)，均来自英国Abcam公司；SYBR Select Master Mix(美国Applied Biosystem公司，批号：4472908)；NF-κB p50抗体(美国Santa Cruz公司，货号：sc-166588)。

1.3 实验仪器倒置荧光显微镜，德国Leica公司；7900H-PCR仪，美国Applied Biosystems公司；ChemiDoc XRS+凝胶成像分析系统，美国Biorad公司；ND2000C紫外可见分光光度计，美国Thermo公司；3600AAA尼龙线栓，广州佳灵生物技术有限公司；Nikon DS-Ril生物数码显微镜，尼康仪器有限公司。

2 方法

2.1 pMCAO模型大鼠制作本动物实验参照Zea Longa的方法进行pMCAO模型大鼠的制备。禁食SD大鼠12 h后，使用腹腔注射2%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)麻醉，于颈部沿中线切开，分离颈总动脉，颈外动脉、颈内动脉，选择颈总动脉开口并用线栓插入，上行至Willis环，至稍感阻力，固定线栓，按要求消毒缝合切口。假手术组不插入线栓，其余手术操作同上。待大鼠清醒参照Longa法[14]对其进行神经功能评分与神经功能缺损评价：0分为无神经损伤；1分为无法完全伸出缺血侧前爪；2分为向缺血侧转圈；3分为向缺血侧倾斜；4分为失去知觉计或丧失自主行走能力，评分在2-3分视为模型成功，可用于后续实验。

2.2 实验动物分组和给药30只大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(pMCAO组)、给药组(pMCAO+Sal组)，大鼠采用线栓法造模成功后，照常饲养，对sham组和pMCAO组大鼠按照10 mL·kg-1·d-1腹腔注射0.9%生理盐水，pMCAO+Sal组按照50 mg·kg-1·d-1腹腔注射红景天苷[15]，给药1 d后，取材。

40只大鼠随机分为假手术组(sham组)、模型组(pMCAO组)、给药组(pMCAO+Sal组)、抑制剂组(pMCAO+Sal+LY组)；调节脑立体定位仪进行定位左侧脑室：以前囟为坐标原点，头尾方向向后移动0.9 mm，左侧移动1.5 mm，深度为3.5 mm，注射10 μL 10 mmol·L-1的PI3K抑制剂 LY294002后(LY294002用含25% DMSO的PBS溶解)，侧脑室注射30 min后，制备pMCAO模型，1 h后，腹腔注射生理盐水或红景天苷，给药1 d后取材。

2.3 Western blot分析脑组织中蛋白的表达水平提取大鼠缺血侧大脑总蛋白进行蛋白浓度的测定，用SDS-PAGE凝胶电泳将蛋白分离后，转移凝胶上的蛋白至PVDF膜上。5%BSA封闭2 h，加入一抗，NeuN稀释比例为1 ∶800，NF-κB p50稀释比例为1 ∶800，β-actin稀释比例为1 ∶3 000，4 ℃摇床孵育12 h。使用TBST洗涤3次，每次10 min后，于按比例稀释的二抗中室温孵育2 h，使用TBST洗涤3次，每次10 min。按比例配置ECL显色剂，行ECL显色剂经凝胶成像分析系统显影，分析目标条带的灰度值。

2.4 RT-qPCR 检测IL-6，TNF-αmRNA表达水平提取细胞总RNA，逆转录成cDNA，以cDNA为模板，荧光定量PCR检测各基因的表达。参照GenBank中大鼠 IL-6、TNF-α的引物序列，IL-6 引物上游序列5′-AGACTTCACAGAGGATACCACCCAC-3′，下游序列 5′-CAATCAGAATTGCCATTGCACAA-3′，PCR 扩增片段长度为 129 bp；TNF-α 引 物 上 游 序 列 5′-GCCACCACGCTCTTC-TGTC-3′；下游序列5′-GCTACGGGCTTGTCACTCG-3′，PCR 扩增片段长度为 149 bp;GAPDH 引物上游序列 5′-CAACGGGAAACCCATCACCA-3′，下游序列 5′-ACGCCAGTAGACTCCACGACAT-3′，PCR 扩增片段长度为96 bp。

2.5 免疫组织化学(IHC)染色测定脑组织中NeuN 的表达大鼠给药1 d后，2%戊巴比妥钠(2 mL·kg-1)麻醉，剪开胸腔，暴露心脏，于心尖处插入灌注针至左心室，并迅速剪开右心耳以形成灌注液排除通道，从左心室快速灌注生理盐水250 mL后，再灌注4%多聚甲醛2 h，然后迅速取脑组织置4%多聚甲醛中固定24 h。使用脑膜将全脑冠状均等分成6片，进行脱水、石蜡包埋及切片。脑组织切片进行荧光染色后使用激光共聚焦显微镜观察、拍照，记录结果，并用ZEN LIGHT软件检测荧光信号。

3 结果

3.1 红景天苷对pMCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN的作用免疫荧光染色结果显示，与sham组比较，pMCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN表达明显减低，经Sal作用后，其能够明显促进pMCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN表达量，且差异具有统计学意义(P<0.05)；同时，Western blot结果表明，与sham组比较，pMCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN蛋白表达降低，经Sal作用后，pMCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN蛋白明显增多，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 1。

3.2 红景天苷对pMCAO大鼠缺血侧脑组织Akt的作用Western blot结果表明，与sham组比较，pMCAO组大鼠缺血侧脑组织Akt蛋白的磷酸化水平表达明显减少，经Sal作用后，pMCAO大鼠缺血侧脑组织Akt蛋白磷酸化水平明显升高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 2，同时，Sal对pMCAO大鼠缺血侧脑组织总Akt的蛋白没有影响。

Fig 1 Effect of salidroside on NeuN immunofluorescence expression and protein in pMCAO rats*P<0.05,**P<0.01 vs sham;#P<0.05,##P<0.01 vs pMCAO

Fig 2 Effects of salidroside on Akt in pMCAO rats**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO

3.3 红景天苷对pMCAO大鼠缺血侧脑组织核蛋白NF-κB p50和炎症因子IL-6和TNF-α mRNA表达影响与sham组相比，pMCAO组核蛋白NF-κB p50，及炎症因子TNF-α和IL-6 mRNA表达明显增加，经Sal作用后，pMCAO大鼠缺血侧脑组织核蛋白NF-κB p50、IL-6和TNF-α mRNA表达明显降低，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 3。

3.4 红景天苷对pMCAO大鼠缺血侧脑组织NeuN及炎症因子的影响本实验通过侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002后30 min，pMCAO造模，检测相关蛋白及炎症因子的表达水平。与pMCAO+Sal组比较，pMCAO+Sal+LY组p-Akt蛋白表达明显受抑制，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见Fig 4，表明LY294002能够抑制Sal所引起的Akt蛋白磷酸化水平；同时，检测缺血侧脑组织NeuN蛋白、核蛋白NF-κB p50和炎症因子IL-6和TNF-α mRNA表达，研究结果显示，与pMCAO+Sal组比较，pMCAO+Sal+LY组，其NeuN蛋白降低，TNF-α和IL-6的mRNA表达明显增加，核蛋白p50表达上调，差异均具有统计学意义，见Fig 5。

Fig 3 Effect of salidroside on nucleoprotein NF-κB p50,IL-6 and TNF-α mRNA in pMCAO rats**P<0.01 vs sham;#P<0.05,##P<0.01 vs pMCAO

Fig 4 Effect of salidroside on Akt protein in pMCAO rats after injection of PI3K inhibitor LY294002 into lateral ventricle**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO;△△P<0.01 vs pMCAO+Sal

Fig 5 Effects of salidroside on NeuN protein,nucleoprotein NF-κB p50 and inflammatory markers in pMCAO rats after injection of PI3K inhibitor LY294002 into lateral ventricle**P<0.01 vs sham;##P<0.01 vs pMCAO;△△P<0.01 vs pMCAO+Sal

4 讨论

PI3K/Akt通路作为一条经典且作用广泛的信号途径，涉及氧化应激、炎症反应、细胞增殖和凋亡等诸多方面。课题组前期研究发现，Sal能有效减少pMCAO大鼠大脑梗死体积[8]，抑制炎症因子，故本实验通过抑制PI3K来研究PI3K/Akt信号通路及对Sal作用的影响，深入探讨Sal的药理的分子作用机制。目前，PI3K抑制剂包括单纯PI3K抑制剂(Pan-PI3K Inhibitors)和选择性PI3K抑制剂Selective PI3K Inhibitors)两种。本实验采用广泛应用的LY294002进行实验。LY294002是一种分子量大小为307.34的化合物，属于单纯PI3K抑制剂，可同时抑制p110α、p110β和p110δ 3个亚型，使下游多条信号通路失活，已广泛用于脑缺血损伤机制研究。本实验通过侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002l对pMCAO大鼠脑内PI3K/Akt通路阻断后，进而研究其对Sal的神经保护作用的影响。研究发现，在pMCAO大鼠中，Sal可促进pMCAO大鼠缺血侧脑组织Akt蛋白的磷酸化水平，增加NeuN蛋白表达，抑制核蛋白NF-κB p50的核转录水平，抑制炎症因子IL-6和TNF-α的mRNA水平，表明Sal可能通过激活PI3K/Akt通路，抑制NF-κB p50的核转录，进而抑制炎症因子表达，上调神经元标志物NeuN蛋白表达。通过侧脑室注射PI3K抑制剂LY294002后，在进一步的实验中发现，PI3K抑制剂LY294002能够逆转以上Sal的干预作用，表明在pMCAO模型中，Sal的神经保护作用机制与激活PI3K/Akt信号通路，抑制NF-κB核转录与炎症因子的表达，上调神经元标志物NeuN蛋白表达有关。

综上，Sal能够通过调控PI3K/AKT信号通路，抑制NF-κB p50核转录水平，进而抑制炎症因子，进而对pMCAO模型大鼠具有神经保护的作用。