小鼠非酒精性脂肪肝纤维化对骨微结构的影响及姜黄素治疗作用

王铜浩 唐飞 田永刚 陈志清 郑金鑫

1.天津市人工细胞工程技术研究中心；天津市重症疾病体外生命支持重点实验室；天津市肝胆疾病研究所；天津市第三中心医院骨科，天津 300170 2.天津市第三中心医院消化科/肝内科，天津 300170

非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是最常见的慢性代谢性肝病之一，是一种广泛的肝脏损害的病理状态，范围从单纯性脂肪变性到非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纤维化。在最近的流行病学研究中发现NAFLD与骨质疏松症显著相关[1]。一些研究支持低骨密度(BMD)与NAFLD关系密切[2-3]，而Kaya等[4]发现NAFLD对骨密度有促进作用，并且这种促进作用与血清细胞因子水平无关。因此NAFLD和骨密度之间关系仍然存在争议。此外，虽然脂肪肝与骨质疏松的研究已经不少，但NAFLD纤维化与骨质疏松相关性研究很少，并且目前临床上还没有找到一种药物能够有效的改善NAFLD纤维化及其并发症。本研究应用高脂饮食(HFD)诱导非酒精性脂肪肝(NAFLD)纤维化模型小鼠，并给予姜黄素治疗，通过micro-CT分析胫骨近端，探讨NAFLD纤维化对骨微结构及骨密度的影响及姜黄素的治疗作用。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6周龄雌性野生型C57BL/6小鼠30只，体重(20±2)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号[SCXK(京)2016-0006]。实验动物常规饲养于天津第三中心医院肝胆研究所清洁级动物房，12 h光照和黑夜循环，温度21～22 ℃, 相对湿度50 %～60 %，动物自由采食和饮水。

1.2 实验方法

1.2.1动物分组与处理：小鼠适应1周后，随机平均分为3组：对照组(WT组)；高脂饮食组(HFD组) 和姜黄素治疗组(HFD+Cur组)。正常对照组给予普通饲料饲喂，高脂饮食组给予高脂饮食饲养(60 %的能量来自脂肪)建立NAFLD小鼠模型，姜黄素治疗组除了给予高脂饮食外，在24周时同时给予姜黄素治疗(以重量的3 %加入高脂饮食，纯度>96 %，购于Sigma公司)，有研究表明这一浓度的姜黄素可以逆转与NAFLD相关的代谢紊乱[5]。饲养方式均为自由饮食，饮水。

1.2.2取材及标本制备：第32周末，结束实验，喂养期间HFD组有1只小鼠死亡，剩余大鼠称体重并记录，禁食12 h后均用戊巴比妥钠(50 mg/kg，腹腔注射)麻醉，断头处死，所有小鼠收集血样，静置15～20 min，离心分离血清(4 000 r/min, 10 min)。将血清在-20 ℃保存，同时分离两侧胫骨，剥离附着的肌肉组织后，在4°C磷酸盐缓冲的福尔马林(PBF，pH 7.4)中保存24 h，然后每个样本与70 %乙醇脱水48 h，纵向放置在充满70 %乙醇的试管中，直到使用。

1.2.3血清生化检测：应用日立全自动生化分析仪(日本)检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、三酰甘油(TG) 和胆固醇(TC) 水平，应用Quick EIATM小鼠TNF-α ELISA试剂盒和Quick EIATM小鼠IL-6 ELISA试剂盒(Dakewe biotech Company Limited)检测各小鼠血清中的细胞因子TNF-α和IL-6表达水平，分别使用放射免疫分析试剂盒(ALPCO, Windham, NH)和ELISA试剂盒(Insight Genomics, Falls Church, VA)测定血清胰岛素样生长因子-1 (IGF-1)和胰岛素样生长因子结合蛋白-1 (IGFBP-1)的水平。

1.2.4肝组织病理学检测：切除小鼠肝脏同一部位，置于4 %多聚甲醛(PFA) 中固定24 h，然后脱水12 h，蜡包埋、切片，用二甲苯透明，梯度乙醇脱水，HE染色后进行光镜病理学检测。

1.2.5Micro-CT扫描：将样本放入含有70 %乙醇的圆柱形塑料管中，密封塑料管，放入micro-CT(Skyscan 1076 micro-CT system；skyscan，Aartselaar，Belgium)中进行胫骨近端扫描，扫描过程360 °旋转，电压50 kV，电流200 μA，曝光时间2 000 ms/帧，分辨率9.0 μm×9.0 μm×9.0 μm，将样本周围的增量角设置为0.5 °，自胫骨干骺端1.5 mm处向下扫描300个片段，该区骨小梁数目较为丰富，将获得的扫描图像导入医学影像三维重建软件Mimics 17.0软件(Materialise Company, Leuven, Belgium)。对骨密度(BMD)、骨小梁间距(trabecular separation，Tb.Sp)、骨体积比(bone volume/total volume，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁数目(trabecular number，Tb.N)、连接密度(connectivity density，Conn.D)，皮质厚度(cortical thickness，C.Th)进行形态学测量和分析。其中测定的骨密度包括骨小梁容积密度(trabecular volumetric BMD，vBMD)，代表骨小梁器官水平上的骨密度，和组织骨密度(tissue BMD，tBMD)，代表骨小梁组织水平上的骨密度

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 体重变化及血清中ALT、AST、TC 和TG 的水平

与WT组相比，HFD组血清中AST明显升高(P<0.05)，而体重、TC、ALT升高更加明显(P<0.01)；与HFD组相比，姜黄素治疗后小鼠体重以及血清中AST、TC、ALT水平明显下降(P<0.05)，更接近于WT组(P>0.05)；但3组小鼠血清中TG的水平变化不明显，差异无统计学意义。见表1。

表 1 小鼠体重及血清ALT、AST、TG 和TC 水平Table 1 Body weight and serum levels of ALT, AST, TG and TC in mice

2.2 血清炎性细胞因子，IGF-1及IGFBP-1水平

与WT组相比，HFD组小鼠血清中炎性细胞因子IL-6和TNF-α水平明显升高(P<0.05)，而IGF-1和IGFBP-1水平变化更加明显(P<0.01)；经姜黄素治疗后，IL-6、TNF-α、IGFBP-1水平明显下降(P<0.05)，IGF-1水平明显升高(P<0.05)，各指标均接近WT组(P>0.05)。见表2。

表 2 各组小鼠血清中IL-6、TNF-α、IGF-1、IGFBP-1水平

2.3 各组小鼠胫骨近端骨微结构及骨密度参数

HFD组小鼠胫骨近端参数BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp、Conn.D、C.Th、vBMD、tBMD及骨干形态与WT组相比差异具有统计学意义(P<0.05、P<0.01)，见表3，图1 E，姜黄素治疗后各小鼠骨微结构及骨密度参数及骨干形态较HFD组明显好转(P<0.05、P<0.01，图1F)，部分参数接近WT组(P>0.05)。

表 3 各组小鼠骨微结构及骨密度参数变化Table 3 Changes of bone microstructure and bone density parameters in each group of mice

2.4 肝脏的组织病理学改变及胫骨近端骨形态变化

WT组小鼠肝组织细胞大小、结构、形态正常，肝小叶规则(图1 A)。HFD组小鼠肝细胞肿胀明显，体积明显增大，出现明显脂肪变性，细胞质内可见大小不等的脂肪空泡，并伴有炎症细胞的浸润和灶状肝细胞坏死，以及汇管区组织纤维化增生(图1 B)。HFD+Cur 组小鼠肝细胞体积明显小于HFD组，脂肪变性及炎性程度明显轻于HFD组，未见明显坏死灶及纤维化(图1 C)

应用Micro-CT扫描各组小鼠胫骨近端，经过三维重建后可清晰的显示骨形态变化，通过进行图像之间的比较分析，我们可以更加直观、形象地发现HFD组小鼠(图1 E)与WT组小鼠(图1 D)相比胫骨近端骨小梁数目减少、骨小梁间隙增宽、皮质厚度变薄，而经过姜黄素治疗后各指标出现明显好转(图1 F)。

注：A，D：WT组；B，E：HFD；C，F：HFD+cur。黑色箭头所示炎细胞浸润；红色箭头显示骨小梁，骨皮质变化。图1 各组小鼠肝脏组织病理学变化及胫骨近端骨微结构变化(200×)Fig.1 Histopathological changes of liver and bone microstructure changes of proximal tibia of mice in each group(200×)

3 讨论

近些年来，人们对NAFLD与骨质疏松的联系进行了临床以及流行病学研究，然而，迄今为止所得到的一些证据存在相互间矛盾[6]。而NAFLD纤维化与骨密度的关系及发病机制更鲜有研究。在C57BL/6小鼠中，通过60 %的脂肪能量诱导NAFLD发生的代谢改变与人类代谢综合征相似，包括血脂异常、炎症和肥胖[7]。Li等[8]发现小鼠NAFLD模型在24周时肝脏出现纤维化，32周时纤维化更加明显。故本研究在24周时给予姜黄素治疗，32周末行肝脏病理及骨组织Micro-CT检测，探讨HFD诱导的NAFLD纤维化小鼠模型的骨微结构，骨密度变化及发病机制，同时研究了姜黄素的治疗效果。

由于复杂多因素机制，肝纤维化与低骨量相关病理生理学尚不清楚。我们发现HFD组小鼠在32周时体重、AST、TC、ALT明显升高，病理出现明显纤维化，炎性因子IL-6、TNF-α明显升高，同时伴有骨微结构及骨密度变化，出现明显骨质疏松。细胞炎性因子作为肝纤维化，肝硬化的介质，在NAFLD疾病发展过程中起到至关重要的作用[9]。而IL-6与TNF-α作为最重要的炎性因子在NAFLD肝纤维化患者中明显升高，并且与肝纤维化程度正相关[10]。同时慢性炎症也是骨质疏松症的危险因素之一，因为炎性细胞因子的激活可导致骨质流失[11]。IL-6是骨吸收明显的促进剂，促进破骨细胞前体的分化，增加破骨细胞活性，促进骨吸收[12]，而血清TNF-α水平升高则直接刺激破骨细胞的成熟与活化，并刺激成熟的破骨细胞分泌IL-6[13]，二者共同促进破骨细胞形成，使骨吸收增加，导致骨质疏松发生。因此，将NAFLD纤维化与骨质疏松症联系起来的一个重要原因是慢性炎症的出现。

相对于炎性因子的变化，我们发现IGF-1、IGFBP-1变化更加明显。与WT组相比，HFD组IGF-1出现明显下降，IGFBP-1出现明显升高。有研究发现与健康对照组相比，NAFLD患者的IGF-1水平较低，并且IGF-1水平与NAFLD的组织学严重程度呈负相关[14],而IGF-1是骨细胞功能最重要的调节因子之一，因为它对骨骼具有合成代谢作用[15]。在6个月和19个月大的小鼠中，肝脏来源的IGF-1被证明是正常皮质骨量所必需的，IGF-1的缺乏导致了骨皮质孔隙率的增加[16]。另外研究表明，血清IGFBP-1和IGF-I水平与NAFLD患者的晚期纤维化之间存在相关性[17]。IGFBP-1主要在肝脏中产生，是6种可特异性结合IGF-1并调节其功能和生物利用度的可溶性结合蛋白之一，循环中的IGFBP-1具有跨越毛细血管屏障的能力，对细胞水平产生直接影响[18]，这意味着血清IGFBP-1高水平能够反映骨组织中高水平的IGFBP-1[19]。据报道，IGFBP-1越高的女性肌肉质量越低[20]。最近的一项前瞻性研究(10年随访)发现老年女性血清IGFBP-1和骨质疏松性骨折之间的呈正相关，并且IGFBP-1对骨组织的作用独立于IGF-1[21]。这表明IGFBP-1可能在骨代谢有重要作用，并可能保持成年小鼠的骨小梁。因此，我们推测IGF-I和IGFBP-1对NAFLD纤维化期骨组织和BMD的变化起到更加重要的作用。

姜黄素是从姜黄根部提炼的最主要的色素成分，是一种历史悠久并用于治疗多种疾病的草本药物[22]。在HFD诱导的非酒精性脂肪肝小鼠中，姜黄素能够改善胰岛素抵抗和肝脂肪变性[23]，并且姜黄素可显著降低HFD小鼠的脂质过氧化和活性氧对细胞的损伤，有望成为预防NAFLD的有效手段[24]。在我们研究中同样也发现了姜黄素降低HFD组小鼠血清中ALT、TG和TC水平，减少脂肪聚集。此外，补充姜黄素也有助于预防和治疗骨质疏松[25]。然而，迄今为止，还没有关于姜黄素对NAFLD骨微结构或BMD影响的临床或动物研究。

姜黄素是一种高度多效性的分子，能够与炎症相关的许多分子靶点相互作用。在APP/PS1转基因小鼠中，姜黄素通过降低小鼠体内炎性因子TNF-α、IL-6的水平，从而改善骨微结构，增加骨密度[26]。在HFD诱导的非酒精性脂肪肝小鼠中，姜黄素可抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-6的表达，从而减轻肝脏炎症[27]，而这些细胞因子与骨质疏松症密切相关，因此姜黄素可通过降低炎性因子改善骨质量。同时研究发现姜黄素对IGF-1信号通路具有调节作用[28]。在糖尿病大鼠中，姜黄素通过上调IGF-1基因降低血糖，改善糖尿病诱导的氧化应激[29]。而对于IGFBP，只有Chang等[30]研究发现姜黄素通过诱导口腔癌细胞中IGFBP-5启动子活性来上调IGFBP-5。除此之外，没有发现其他关于姜黄素与IGFBP关系的研究。本研究首次阐明了姜黄素对IGFBP-1的调节作用。因此，我们认为姜黄素在NAFLD纤维化期可能通过调节血清中TNF-α、IL-6、IGF-1和IGFBP-1水平，从而改善骨微结构，增加了皮质厚度及骨密度。

上述研究提示小鼠非酒精性脂肪肝纤维化期可出现明显骨质疏松，血清中TNF-α、IL-6、IGF-1和IGFBP-1变化在发病机制中起到重要的作用，其中IGF-1和IGFBP-1作用尤为重要，而姜黄素调节这些细胞因子可减轻脂质聚集，增加骨小梁，骨皮质及骨密度。由此可见，姜黄素可能是NAFLD纤维化期骨质疏松潜在的治疗手段。然而NAFLD病理机制复杂，仍有许多问题需要阐明，更好地理解骨代谢和肝脏之间的联系，可能会为治疗NAFLD和骨质疏松这两种非常普遍的疾病开辟一个新的领域。