淫羊藿治疗糖皮质激素性骨质疏松症分子机制的网络药理学分析

许坤 庞坚* 张洁帆 王用玉 赵咏芳 郭海玲

1.上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心，上海 200120 2.上海市中医药研究院骨伤科研究所，上海 200120

糖皮质激素性骨质疏松症(glucocorticoid-induced osteoporosis, GIOP)是由于长期使用糖皮质激素造成骨密度和骨量下降、骨质结构遭到破坏，导致骨脆性增强、骨折风险增加的代谢性骨病，是最常见的继发性骨质疏松症[1]。至今，糖皮质激素(glucocorticoid，GC))类药物在临床仍是无可替代的，虽然GC的使用会产生明显的不良反应，包括骨量丢失和骨折[2-3]。接受GC长期治疗的患者中，约10 %以上被临床诊断发生骨折，而30 %～40 %的患者具有椎骨骨折的影像学证据[4-5]。GIOP已经成为世界范围的日益严重的健康问题。在补充钙剂、维生素D与改变生活方式的基础上，双膦酸盐类药物仍是受推荐的一线药物[6]，但随着双膦酸盐治疗时间的延长，骨坏死、非典型股骨骨折的发生率都见增加[7]，可能由于骨吸收抑制剂与GC同时使用，导致骨形成进一步减少，从而妨碍骨的重建所致。因此，目前GIOP的临床治疗仍然存在着广泛的争议[8]。

淫羊藿[9]又名仙灵脾，来源于毛茛目小檗科淫羊藿属植物。祖国传统医学认为其性温，味辛、甘，入肝、肾经，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的功效，常用于治疗肾阳虚衰、筋痿骨软、风湿痹痛等症。多项文献研究[10-11]显示，在防治骨质疏松的中医药处方中，淫羊藿为其中使用频率最高的药物。而现代药理学研究[12]显示，淫羊藿组分能促进成骨细胞分化、抑制破骨细胞活性与抑制GC诱导的骨细胞凋亡，故而淫羊藿在GIOP防治领域具有广阔研究空间与开发潜力。淫羊藿的成分复杂，进一步探索淫羊藿治疗GIOP的具体药物分子机制实属必要。

本研究基于中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)、GeneCards数据库、OMIM数据库、R软件(v4.0.0)、perl软件(v5.28.1)、UniProt数据库、Cytoscape软件(v3.7.0)、String在线软件(v11.0)等研究工具，从分子水平探讨淫羊藿治疗GIOP的潜在药物成分及机制，为后续药物研发提供基础。

1 材料和方法

1.1 筛选淫羊藿的活性成分

中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP：http://http://tcmspw.com/tcmsp.php)是世界上最大的非商业中药分子数据库之一，收集了《中国药典》中收录的499味中草药，包括3 311个靶点和29 384种成分[13]，形成了一个统一完整的中药药效学预测与验证体系。口服生物利用度(OB)是口服药物重要的药代动力学性质之一，它对药物进入体循环的效率起着重要的作用。类药性(DL)是一个定性概念，旨在帮助优化药物动力学和药物特性。本研究确定淫羊藿的活性成分筛选标准为OB>30 %，DL>0.18。

1.2 将淫羊藿活性成分进行靶点预测，并对靶点添加基因名

利用TCMSP开发的靶点预测模型，进一步预测了淫羊藿活性成分的相关靶点，再通过perl软件和UniProt (http://www.uniprot.org/) 数据库对预测出的靶点进行添加基因名。

1.3 获取GIOP的靶点基因

GeneCards[14]数据库(https://www.genecards.org/)是一个将人类基因、编码的蛋白质的功能以及所涉及的疾病整合为一体的数据库。Online Mendelian Inheritance in Man(OMIM)数据库[15](https://omim.org/)是有关基因和遗传表型及其之间关系的数据库。将“glucocorticoid induced osteoporosis”作为关键词，通过GeneCards和OMIM两个数据库同时搜索GIOP的靶点基因，去除两个数据库中的重复结果，获得GIOP疾病靶点基因。最后利用R软件将淫羊藿靶点基因与GIOP靶点基因进行交集分析，并绘制出韦恩图。

1.4 构建“淫羊藿-GIOP”调控网络

运用perl软件将淫羊藿靶点基因与“淫羊藿-GIOP”共同靶点基因一一映射，再将数据导入Cytoscape软件进行可视化处理，得到“淫羊藿-GIOP”调控网络。

1.5 构建淫羊藿治疗GIOP的靶点基因蛋白互作(PPI)网络

将“淫羊藿-GIOP”共同靶点基因数据导入String在线软件(https://string-db.org/)，选择种属为“Homo sapiens”，设置最小互作得分为0.4，构建出PPI网络，并导出相关数据。

1.6 筛选PPI网络核心靶点基因

将1.5导出的PPI网络数据利用R软件进行计算，得到PPI网络核心基因条图。

1.7 GO和KEGG功能富集分析

为进一步阐述淫羊藿对GIOP的作用机制，将“淫羊藿-GIOP”共同靶点基因数据导入R软件，进行GO功能富集分析和KEGG功能富集分析，并绘制出相关柱状图及气泡图。

2 结果

2.1 淫羊藿活性成分的筛选

通过TCMSP数据库一共检索到淫羊藿130个活性成分，再根据制定的筛选标准(OB>30 %，DL>0.18)进行筛选，得到淫羊藿23个主要活性成分，见表1。

表1 淫羊藿主要活性成分表Table 1 Main active components of herba epimedii

2.2 淫羊藿活性成分靶点预测

将筛选出的淫羊藿活性成分进行靶点预测后，再通过perl软件和UniProt数据库对预测出的靶点添加基因名，去除UniProt数据库中检索不到的靶点和重复靶点，最终获得106个淫羊藿活性成分靶点。

2.3 获取GIOP靶点基因与淫羊藿活性成分靶点取交集

通过GeneCards数据库检索，获得1 519个GIOP相关靶点基因，通过OMIM数据库检索，得到185条GIOP疾病相关靶点，将两个数据库检索结果合并后剔除重复靶点，最终获得1 801个GIOP疾病靶点基因。再将其与淫羊藿活性成分靶点取交集，结果显示(图 1)“淫羊藿-GIOP”交集靶基因共有65个。

图1 “淫羊藿-GIOP”交集靶基因Fig.1 Regulatory network diagram of herba epimedii-GIOP

2.4 “淫羊藿-GIOP”调控网络构建

通过Cytoscape软件将数据进行可视化处理，得到“淫羊藿-GIOP”调控网络图(图 2)。图中菱形表示GIOP，六边形表示中药淫羊藿，三角形表示淫羊藿的活性成分，椭圆形表示GIOP和淫羊藿的共同靶点基因。图中显示，淫羊藿主要通过20个活性成分作用于65个靶点基因来调控GIOP的疾病的发生。

图2 “淫羊藿-GIOP”调控网络图Fig.2 Regulatory network diagram of herba epimedii-GIOP

2.5 淫羊藿治疗GIOP的靶点基因的PPI网络构建

运用String在线软件构建出“淫羊藿-GIOP”共同靶点基因的PPI网络(图 3)，图中显示一共有64个节点，622条相互关系。通过各节点之间的相互关系，筛选出连接次数较多的5个靶点基因作为核心靶点基因(图 4)，分别为白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝裂原激活蛋白激酶-8(MAPK8)、胱冬酶-3(CASP3)、雌激素受体-1(ESR1)。

图3 “淫羊藿-GIOP”共同靶点基因PPI网络Fig.3 PPI network of common target gene of herba epimedii-GIOP

图4 核心靶点基因Fig.4 Core target genes

2.6 GO功能富集分析

将淫羊藿治疗GIOP的核心靶点基因进行GO功能富集分析后得到如下柱状图(图5)和气泡图(图6)。图中显示，淫羊藿治疗GIOP的核心靶点基因的GO功能主要包括核受体活性(nuclear receptor activity)、转录因子活性(transcription factor activity, direct ligand regulated sequence-specific DNA binding)、类固醇激素受体活性(steroid hormone receptor activity)、DNA结合转录剂活性(DNA-binding transcription activator activity, RNA polymerase II-specific)、类固醇结合(steroid binding)、RNA聚合酶II转录因子结合(RNA polymerase II transcription factor binding)、半胱氨酸型内肽酶活性与细胞凋亡的关系(cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process)、核激素受体结合(nuclear hormone receptor binding)、泛素样蛋白连接酶结合(ubiquitin-like protein ligase binding)、氧化还原酶活性(oxidoreductase activity)、激素受体结合(hormone receptor binding)、泛素蛋白连接酶结合(ubiquitin protein ligase binding)、激活转录因子结合(activating transcription factor binding)、雌激素受体结合(estrogen receptor binding)、类固醇激素受体结合(steroid hormone receptor binding)、单加氧酶活性(monooxygenase activity)、RNA聚合酶II基础转录因子结合(RNA polymerase II basal transcription factor binding)等。由此可以推测出淫羊藿的活性成分主要通过调节以上生物功能来发挥其治疗GIOP的功效。

图5 GO柱状图Fig.5 GO bar plot

图6 GO气泡图Fig.6 GO dot plot

柱状图和气泡图左侧为GO名称；柱状图下面的数字表示富集基因数目，气泡图下面的数字表示基因比例；气泡图中气泡大小表示富集基因数目，气泡越大，富集基因越多；柱状图和气泡图中的图形均按P值着色，P值越小，颜色越红，富集程度越高。

2.7 KEGG通路富集分析

将淫羊藿治疗GIOP的核心靶点基因进行KEGG功能富集分析后得到如下柱状图(图 7)和气泡图(图 8)。图中显示，淫羊藿治疗GIOP的核心靶点基因的KEGG通路主要有前列腺癌信号通路(prostate cancer)、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染信号通路(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)、细胞凋亡信号通路(apoptosis)、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路(fluid shear stress and atherosclerosis)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、乙肝病毒信号通路(hepatitis B)、麻疹信号通路(measles)、结直肠癌信号通路(colorectal cancer)、人巨细胞病毒感染信号通路(human cytomegalovirus infection)、甲状腺素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)等。由此可以推测出淫羊藿的活性成分有可能通过调节这些信号通路来发挥其治疗GIOP的功效。

图7 KEGG柱状图Fig.7 KEGG bar plot

图8 KEGG气泡图Fig.8 KEGG dot plot

柱状图和气泡图左侧为KEGG名称；柱状图下面的数字表示富集基因数目，气泡图下面的数字表示基因比例；气泡图中气泡大小表示富集基因数目，气泡越大，富集基因越多；柱状图和气泡图中的图形均按P值着色，P值越小，颜色越红，富集程度越高。

3 讨论

基于“疾病-基因-靶点-药物”作用网络，网络药理学技术整合了系统生物学、生物信息学等多学科研究药物活性成分作用机制的新方法，通过系统分析药物对疾病网络的干预和影响，从活性成分、蛋白靶点等分子水平揭示药物潜在作用机理，使得快速高效地探索中药的多成分、多靶点、多途径的作用机制成为可能。既往已有学者进行过淫羊藿治疗骨质疏松症[16]、绝经后骨质疏松症[17]、激素性股骨头坏死[18]的相关机制研究。而淫羊藿在GIOP的临床治疗中运用广且疗效佳，但对其相关机制研究的报道甚少，故笔者将其作为研究方向。

研究结果提示，淫羊藿可能通过多成分、多靶点、多通路影响GIOP的发病。淫羊藿治疗GIOP的5个核心基因分别为白细胞介素-6(IL-6)、血管内皮生长因子A(VEGFA)、丝裂原激活蛋白激酶-8(MAPK8)、胱冬酶-3(CASP3)、雌激素受体-1(ESR1)。文娱等[19]在一项骨质疏松小鼠模型的实验研究中发现，淫羊藿苷可以通过下调骨组织中IL-6的阳性表达，从而抑制骨质吸收，达到抗骨质疏松的作用。VEGFA是VEGF家族中的一种，VEGF可以通过增强成骨细胞中的碱性磷酸酶活性[20]，从而促进成骨细胞的增殖与分化，改善骨质。游利[21]通过细胞实验发现，干预CASP3的表达可以增强碱性磷酸酶活性，诱导成骨相关基因的表达。雌激素在骨代谢的过程中发挥着重要作用[22]，研究[23]表明，骨细胞中的ERα可通过调节骨小梁的形成抑制骨质疏松。

研究发现，淫羊藿治疗GIOP的相关分子机制主要集中在与细胞增殖分化、免疫和内分泌相关的3类途径中，主要包括前列腺癌信号通路、细胞凋亡信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路、糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路、乙肝病毒信号通路和麻疹信号通路等，提示淫羊藿可能通过这些信号通路来影响GIOP的发展。①前列腺癌信号通路：有研究者[24]对日本长期接受雄激素剥夺治疗的前列腺癌患者进行调查，调查结果显示接受雄激素剥夺治疗6年后的前列腺癌患者，骨质疏松症患病率达到45 %，而且随着接受雄激素剥夺治疗时间的延长，前列腺癌患者的骨质疏松患病率有统计学意义的增加，可见骨密度变化与前列腺癌及其治疗方式有关。②细胞凋亡信号通路：细胞凋亡信号与GIOP的发病关系密切，Sato等[25]通过研究发现，GC通过诱导Pyk2磷酸化，促进成骨细胞和骨细胞凋亡，延长破骨细胞的寿命，导致骨吸收增加，从而引起GIOP的发病。③流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路：有研究[26]发现，在动脉粥样硬化疾病的发病过程中，骨保护素通过参与调控血管因子发挥作用，而骨保护素同时也是参与骨代谢的重要蛋白，因此笔者推测骨保护素通过参与调控动脉粥样硬化信号通路从而影响了GIOP的发病。④TNF信号通路：TNF-α因子可以通过加快骨质吸收、抑制骨质再生，在调节骨代谢的过程中发挥着重要作用[27]。⑤糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路：王寓平[28]通过实验发现，AGEs/RAGE对内皮祖细胞转化为成骨细胞具有积极作用，由此可以推测AGEs/RAGE信号通路与骨质疏松疾病的发展存在关系。⑥乙肝病毒信号通路：王三杏等[29]通过对1 033例体检数据进行分析，发现骨质疏松患者的乙肝感染率明显高于骨质正常者，提示骨质疏松与乙肝病毒可能存在一定关系。⑦麻疹信号通路：麻疹与GIOP发病机制的相关研究报道较少，有待进一步研究。

综上所述，淫羊藿有可能是通过前列腺癌信号通路、细胞凋亡信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、TNF信号通路和糖尿病并发症中AGE-RAGE信号通路等多个途径作用于白细胞介素-6、血管内皮生长因子A、丝裂原激活蛋白激酶-8、胱冬酶-3和雌激素受体-1等靶点参与调节骨形成和破骨吸收之间的平衡，从而达到防治GIOP的作用。此次基于多个数据库运用网络药理学方法对淫羊藿治疗GIOP的分子机制研究，为后期的药效机制研究提供了新的思路和方向。由于网络药理学方法所涉及的数据库及软件算法等多方面有着一定的局限性，因此为取得更加可靠的研究结果，还需进一步通过实验验证。