当归多糖对C57BL/6小鼠毛囊及毛发生长的影响

王月莹 李婵婵 谢 君 姚小敏 宋继权

武汉大学中南医院皮肤科，武汉，430071

脱发在日常生活中极为多见，临床可见的脱发性疾病类型也较多，包括脂溢性脱发、斑秃、药物诱导的生长期脱发等[1]。近年来随着生活工作压力的增大以及人们对自身外表要求的提高，因脱发性疾病带来的心理与精神压力对人们的日常生活产生严重负面影响，对改善脱发的需求也日益增加,但临床对于脱发的治疗手段仍是有限的，且脱发性疾病的病理生理机制仍待探究。当归是著名的中草药之一，凭借其等广泛的药理活性在现代临床心脑血管、抗肿瘤、血液系统疾病、消化系统疾病、妇科疾病等方面也得到了诸多的应用[2,3]。当归多糖(angelica sinensis polysaccharide, ASP)作为当归发挥药理活性的主要成分之一，具有造血活性、抗氧化活性、免疫调节活性、抗菌消炎等作用[4]。目前当归多糖虽广泛应用于多个领域，但在脱发性疾病治疗的方面的应用较为少见。本课题组既往研究已初步证实当归多糖对体外毛囊生长具有促进作用。依据中医治疗脱发所主张的内服与外治法，通过建立脱发模型小鼠，采用灌胃与外涂的方法研究当归多糖对促进小鼠毛囊及毛发生长的影响，以期为日后的临床应用提供更多可行性依据。

1 材料与方法

1.1 动物 40只雌性7～8周龄的C57BL/6小鼠，由武汉大学动物实验中心提供，许可证号SCXK(京)2016-0006。从中选择毛发处于静止期且皮色均匀粉红无疤痕的小鼠参与实验研究。

1.2 药品试剂 当归多糖粉剂，20 mg/瓶，由武汉欣申试化工科技有限公司提供，货号：B25568。5%米诺地尔酊搽剂，由武汉大学中南医院皮肤科提供；薇婷脱毛膏 (国妆特进字G20161330)，80 g/瓶，由武汉市武昌区密克斯实验仪器经营部提供。

1.3 主要设备仪器 正置荧光显微镜(日本奥林巴斯，型号：BX53)；全自动数字玻片扫描与分析系统(德国徕卡，型号：Aperio VERSA 8)。

1.4 方法

1.4.1 当归多糖溶液的制备 20 mg/瓶当归多糖粉剂，溶于无菌去离子水中配制成相应浓度的溶液，分别为125 mg/L、500 mg/L、1000 mg/L,作为实验中当归多糖低、中、高剂量组实验试剂，于4℃存储备用。

1.4.2 脱发模型建立 用脱毛膏在小鼠背部固定部位脱毛，面积约为2 cm×3 cm。

1.4.3 分组 将脱毛后36只毛发处于静止期的小鼠随机分为9组，每组4只。(1)当归多糖灌胃组，分别为：当归多糖低、中、高剂量组，去离子水阴性对照组。(2)当归多糖外涂组为：当归多糖低、中、高剂量局部外涂组，米诺地尔酊阳性对照组，去离子水阴性对照组。

1.4.4 给药 脱毛后第二天开始给药；灌胃组、外涂组皆每日定时给药一次，每次给药量为0.2 mL，实验过程中持续用药21 d。

1.5 观察指标及方法

1.5.1 观察并记录小鼠脱毛区皮肤颜色变化及所用时间 每日拍照记录每只小鼠脱毛区皮肤颜色变化及从粉红至灰色、从灰色至出现新生毛发的时间。

1.5.2 对新生毛发生长情况进行评分 参考文献[5，6]脱毛后于第6、9、12 d对脱毛区新生毛发生长状况进行评分，给定评分标准如下：皮肤呈粉红色为0分，呈灰色为1 分，呈黑色为2分，呈黑色并有少许毛发长出为 3分；与其他部位无差别为4分。

1.5.3 HE染色 在用药第4天，从各组中随机选取一只小鼠进行皮肤环钻活检以获取皮肤组织，以及在连续用药21天后，使用脱毛膏脱去实验区毛发，切取小鼠背部固定部位皮肤组织1块，每块长约1.0 cm，先后进行固定脱水、制作石蜡包块、切片后进行HE染色(苏木精-伊红染色)等操作，于显微镜下观察小鼠毛囊位置、数量及形态的变化。60倍显微镜下取5个视野，尽量选取不重叠区域，将5个单位视野内的毛囊计数取平均值。

1.6 统计学方法 将实验记录的结果输入EXCEL建立数据库,应用SPSS 22.0统计分析软件对结果进行统计分析。计量资料结果统一以平均值±标准差表示，将连续性资料行正态性检验，如果服从正态分布，采用单因素方差分析(one-way ANOVA)进行组间比较，如果组间差异有统计学意义，进一步采用LSD方法进行两两比较，否则采用Kruskal-Wallis H检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 当归多糖对小鼠皮肤颜色变灰及毛发长出时间的影响，见表1、2，图1。

分析结果发现，当归多糖低、中剂量灌胃均可在一定程度是上加快小鼠皮肤颜色变化，使小鼠毛发从静止期进入生长期的所需时间减少，两组之间无统计学差异，且当归多糖中剂量灌胃组可加快毛发长出(P<0.05)。当归多糖外涂中、高剂量组与阳性对照组均可显著缩短小鼠皮肤颜色变灰的时间，且外涂高剂量组可显著加快小鼠毛发长出速度(P<0.05)。

2.2 于第6、9、12 d对小鼠背部脱毛区毛发生长状况进行评分(图2、3)。虽然组内差异比较未见明显统计学差异，但从折线图中可以清晰的看到低、中剂量灌胃组小鼠毛发生长评分明显高于阴性对照组；除低剂量组外，其余外涂组小鼠毛发生长评分均显著高于阴性对照组。

表1 灌胃组小鼠皮肤颜色变化的时间

表2 外涂组小鼠皮肤颜色变化的时间

注：图中a、b、c、d所示分别为当归多糖低、中、高剂量灌胃组与阴性对照组

表3 各组小鼠毛囊数量

4a：第4天对照组; 4b：第4天当归多糖中剂量灌胃组; 4c:第21天对照组;4d:第21天当归多糖中剂量灌胃组

2.3 毛囊数量 与灌胃对照组相比，当归多糖低、中剂量灌胃组可促进脱毛区毛囊数目明显增多，组间比较具有明显差异(P<0.05)。与阴性外涂对照组相比，当归多糖低、中、高剂量外涂组及米诺地尔阳性对照组均可促进脱毛区毛囊数目增多，差别具有统计学意义(P<0.05)。毛囊数量并不呈剂量依赖性，各组之间毛囊数量无明显差异(P>0.05)。毛囊数量见表3。

2.4 当归多糖对毛囊位置及形态的影响 见图4。在用药第4天，对照组毛囊数目仍较少，毛囊位置较为表浅，未见明显黑色素产生；当归多糖低、中剂量灌胃组可见明显黑色素形成，毛囊数目明显增多，毛乳头膨大，深入皮下组织。在用药21天后，灌胃对照组毛发呈棒状，毛球部变细小，处于退行期；当归多糖低、中剂量灌胃组毛囊仍可见较多黑色素，毛囊粗长，毛球膨大，多数仍处于生长期。

3 讨论

既往研究表明，脱发患者的生活质量评分(DLQI)明显高于正常人群，表明脱发患者的生活质量确实受到了疾病的影响，诸多患者也因此产生焦虑情绪，迫切需要控制或改善脱发状况以帮助其恢复心理健康、提高生活质量[7]。目前临床用于有关脱发治疗方案有口服非那雄胺、局部外用米诺地尔酊，毛发移植、低能量激光治疗及PRP局部注射等[8]，但当下治疗方案仍多存在费用昂贵，所需时间较长，患者依从性差等问题。当归多糖因其毒性低，药理活性广泛，目前在心脑血管疾病、抗肿瘤、血液系统疾病的治疗等方面均已开展诸多研究[3]，但关于脱发治疗的研究较为少见，是故我们通过本次实验研究其对小鼠毛发生长的影响。本课题组既往研究已初步证实当归多糖对人头皮毛囊生长具有促进作用[9]，本次实验再次证实了将当归多糖对小鼠毛囊及毛发生长亦具有促进作用。

本次实验选用C57BL/6小鼠作为脱发模型小鼠进行实验研究，因该小鼠可通过对其皮肤颜色的观察来推断毛发的生长周期。C57BL/6小鼠皮肤中的黑色素细胞仅于生长期时合成黑色素，使皮肤呈现为黑色，至退行期皮肤慢慢变为灰色，静止期时皮肤恢复至粉红色[10]。我们通过对结果的分析可知，当归多糖低、中剂量灌胃均可显著缩短C57BL/6小鼠脱毛区毛发从静止期进入生长期的时间，促进脱毛区毛囊数目增多，延长毛发生长期且中剂量具有促进小鼠毛发生长加快的作用(P<0.05)，而当归多糖高剂量灌胃组与阴性对照组结果无统计学差异(P>0.05)；当归多糖外涂组各实验组均可促进脱毛区毛囊数目增多，中、高剂量组与阳性对照组也可以显著缩短小鼠毛发从休止期进入生长期的时间(P<0.05)，高剂量组与低、中剂量组相比有统计学差异(P<0.05)，与阳性组对毛发生长的效果无明显差异(P>0.05)。实验的结果说明了适宜剂量当归多糖对小鼠毛囊及毛发生长的积极作用。

本次实验结果可能的原因如下：因小鼠皮肤表面有皮肤屏障，当归多糖作为活血药物，虽有一定的透皮作用，可越高浓度的当归多糖作用于表面，皮内吸收可作用于毛囊微环境的当归多糖浓度越高，从而呈现一定的浓度依赖性。中药内服机制较为复杂，既往研究表明，当归多糖可显著提高大鼠脾淋巴细胞的转化能力、NK细胞杀伤能力和血清IL-2含量，从而得出当归多糖具有增强免疫功能的作用[11]。推测中剂量灌胃组的当归多糖可导致最佳血药浓度，从而促进毛发生长，高浓度口服可能导致了一定程度的免疫耐受。

我们探究当归多糖治疗临床常见类型脱发的可能性。脱发性疾病在临床上多见的有脂溢性脱发、斑秃、瘢痕性脱发等[1]。脂溢性脱发，又称雄激素性脱发，目前认为可能造成脂溢性脱发的发病机制有毛发生长周期的变化、雄激素的影响、遗传机制、有关分子机制及微炎症机制等[8],转化生长因子 (TGF)-β-Smad通路是调节毛囊生长周期的重要信号通路之一[12]。其中 TGF-β1 可能通过Smad3信号通路增加雄激素受体的转录活性[13],朱正新等的研究也表明当归补血汤可以有效降低小鼠体内TGF-β1的表达[14]，抑制雄激素受体的转录活性从而可有效促进毛发生长。斑秃，俗称“鬼剃头”，是一种慢性自身免疫性炎症性的疾病，虽然目前具体的发病机制仍待研究，但氧化应激在斑秃的发病过程中起到一定作用已经得到了许多研究的证实。 Bakry等[15]通过研究发现斑秃患者血清总氧化能力、丙二醛值明显高于健康对照组，抗氧化能力显著低于对照组，重度斑秃患者的氧化应激参数也显著高于轻中度斑秃患者。一篇描述有关斑秃的系统回顾也显示斑秃与氧化应激有关，与轻中度斑秃相比，重度斑秃的氧化参数水平显著升高，研究发现抗氧化剂在斑秃治疗中的使用可能是有益的[16]。临床常见的瘢痕性脱发可分为原发性与继发性两大类。原发性瘢痕性脱发可根据其显著的淋巴细胞、中性粒细胞等炎症细胞浸润模式将其分类，且由于疾病的罕见性，各种治疗方法缺乏有效性证据，目前临床治疗的目的主要是停止或至少延迟脱发和瘢痕形成过程的进展，减少局部炎性症状以及减轻患者自觉症状[17]。继发性瘢痕性脱发常见的情况是继发于各种感染性疾病、烧伤、烫伤等，治疗继发性瘢痕性脱发的重要措施之一也是减轻局部炎症反应[1]。其他类型的临床脱发有生长期缩短所致的休止期脱发及放化疗导致的生长期脱发等；目前多项研究已证实当归多糖具有抗氧化、调节免疫和抗炎、抗辐射损伤的作用[18-21]，通过发挥此类作用，笔者认为当归多糖在治疗各种类型的脱发中具有广阔的应用前景，但仍需对疗效和机制进行更加深入研究。