子宫内膜息肉不孕症患者子宫内膜组织VEGF、Ki-67表达临床意义

闫佼佼 梁国伟 叶瑞珍 周 兰 戴丽红

太原钢铁(集团)有限公司总医院(030003)

子宫内膜息肉是常见的妇科良性疾病，发生率8%～24%，其中0.5%～4.8%可导致子宫内膜恶性病变[1-3]。25%的不孕症者可检出子宫内膜息肉[4-5]。子宫内膜息肉与不孕症发生机制尚未完全阐明[6-7]。研究表明，子宫内膜息肉组织周边存在慢性炎症，其发生可能与细胞因子、细胞增殖、凋亡异常有关[8-9]。血管内皮生长因子(VEGF)是血管形成最重要的驱动因子之一，在子宫内膜生理病理中有具有临床意义。Ki-67是一种细胞增殖抗原，可评估细胞增殖的生物标志物。多项研究表明VEGF、Ki-67在子宫内膜息肉患者表达临床意义[10-11]，而在子宫内膜息肉不孕症中研究较少。为研究VEGF、Ki-67在子宫内膜息肉不孕症中的临床意义，本研究通过分析子宫内膜息肉不孕症患者不同息肉病史、不同子宫内膜周期VEGF、Ki-67水平，探索其临床意义。

1 材料与方法

1.1 资料来源

收集2019年6月-2021年1月本院经宫腔镜确诊为子宫内膜息肉不孕症患者临床资料作为观察组，根据息肉病史分为息肉初发和复发，根据子宫内膜周期变化分为增殖期、种植窗期。纳入标准：子宫内膜息肉均经病理确诊，符合妇产科诊断病理学(第2版)诊断标准；确诊不孕症；提供组织供免疫组化检测。经全面检查排除血、尿常规异常、月经不规律、输卵管子宫畸形、免疫系统疾病、内分泌疾病以及男方因素等导致的不孕症；合并其他子宫、宫颈恶性病变；合并其他恶性肿瘤。同期男方因素导致的不孕症且未见子宫内膜息肉患者为对照组。本研究经本院伦理委员会审批。患者均签署知情同意书。

1.2 一般资料收集

收集纳入对象年龄、不孕时长、基本病史等相关资料。观察组取子宫内膜息肉组织、息肉周边无异常组织(周围组织)，对照组取正常子宫内膜组织。

1.3 免疫组化分析

采用免疫组化检测两组取材组织中VEGF、Ki-67表达。对组织切片、脱蜡，抗原修复。滴加检测抗体(抗VEGF-1：300鼠抗人单克隆抗体、抗Ki-67-1：500兔抗人多克隆抗体)4℃过夜，磷酸缓冲液清洗3次后加入二抗，使用DAB显色，判断染色情况后，苏木精染色后脱水封片，镜检。综合阳性细胞占比(0无阳性细胞，1分1%～5%，2分6%～50%，3分51%～70%，4分71%～100%)和染色强度打分(0分无染色，1分淡黄色；2分棕黄色；3分棕褐色)之和，总评分≥3分定义为阳性表达。

1.4 Real-time PCR检测

采用Trizol法提取各取材组织总RNA。利用cDNA合成试剂盒合成互补DNA(cDNA)。采用SYBR Premix Ex TaqTM进行RT-PCR。使用正反向引物对进行PCR扩增(表1)。记录各孔Ct值取平均值。使用GAPDH进行VEGF、Ki-67相对表达定量。

表1 引物序列

1.5 统计学处理

2 结果

2.1 两组基本情况

本研究共纳入观察组90例、对照组45例。观察组年龄30.8±2.6岁，不孕时长4.7±3.3年；对照组30.5±3.2岁，不孕时长5.0±2.9年。两组年龄、不孕时长均无差异(P>0.05)。

2.2 增殖期VEGF、Ki-67表达情况

根据息肉病史，观察组分为初发60例、复发30例；根据子宫内膜周期分为增殖期62例、种植窗期28例。其中初发32例属于增殖期，复发30例属于增殖期。对照组增殖期24例、种植窗期21例。增殖期观察组初发息肉及复发息肉VEGF阳性率、Ki-67阳性率均高于周围组织及对照组(P<0.05)。见表2。选蛋白表达阳性进行相对表达水平检测，增殖期初发息肉、复发息肉VEGF、Ki-67相对表达水平均高于对照组(P<0.05)。见表3。

表2 增殖期各组织VEGF、Ki-67蛋白表达阳性比较[例(%)]

表3 增殖期各组不同因子相对表达量比较

2.3 种植窗期VEGF、Ki-67表达情况

种植窗期观察组28例，对照组21例。对照组VEGF阳性率(17例，80.9%)高于观察组息肉(8例，28.6%)(P=0.0003)和周围组织(4例，16.7%)(P<0.05)，而观察组息肉与周围组织VEGF阳性率无差异(P=0.193)。Ki-67阳性率观察组息肉(3例，10.7%)、周围组织(1例，3.8%)和对照组(1例，4.8%)比较无差异(P>0.05)。

3 讨论

子宫内膜是一种动态的经历周期性增殖和分化变化的组织。研究表明血管生成参与子宫内膜的生理变化，由VEGF及其受体介导，VEGF在子宫内膜排卵阶段、子宫内膜周期性变化、胚胎着床和发育等生理功能中起到重要作用[12-14]。子宫内膜疾病如平滑肌瘤、子宫内膜异位症、子宫内膜癌、子宫内膜息肉VEGF均有显著变化[15-16]。既往研究报道，子宫内膜息肉可能导致不孕症。机制有：子宫内膜息肉导致的机械性梗阻，子宫内膜息肉引起子宫内膜一系列炎症反应，抑制胚胎发育[17-18]。通过宫腔镜息肉切除术可增加不孕症患者妊娠率，而切除术术后复发率较高。本研究通过分析息肉病史与子宫内膜周期VEGF表达水平，探索VEGF参与子宫内膜息肉不孕症的可能机制。

本研究发现，观察组在增殖期，不论是初发息肉还是复发息肉其组织中VEGF表达水平及相对表达量均高于周围组织及对照组，提示VEGF与子宫内膜息肉不孕症有一定关系；且复发息肉组VEGF阳性率高于初发息肉者，提示VEGF高表达可能是息肉复发的一个分子指征。既往研究提示VEGF在增殖期到分泌阶段表达水平增加，促进内皮细胞增生，血管形成；种植窗期VEGF表达有助于胚胎着床和绒毛血管新生。本研究种植窗期观察组VEGF阳性率低于对照组，表明不孕症患者子宫内膜血流灌注减少，影响子宫内膜容受性，导致胚胎着床失败[19-20]。

Ki-67作为一种增殖标记物，在细胞周期中表达开始出现在G1期，在S期和G2期增加，在M期达到高峰，在G0期中迅速消失[21]。本研究，增殖期，观察组Ki-67阳性率无论是初发息肉还是复发息肉，其组织中Ki-67表达水平、相对表达量均高于对照组，表明在增殖期Ki-67可能参与子宫内膜息肉的形成与复发；种植窗期，Ki-67阳性表达在观察组和对照组均极低，表明增殖处于低水平，有助于子宫内膜脱落。

综上所述，在子宫内膜增殖期VEGF、Ki-67在内膜息肉组织中异常高表达，可能参与了子宫内膜息肉的形成与复发；在种植窗期VEGF低表达可能导致子宫内膜容受性变差，进而引发不孕症。