交泰丸治疗失眠与口疮的网络药理学机制研究

王蔚陆杨若聪贾彩霞庞小涵陈与丰陈愉李思琪赵慧辉

1.北京中医药大学中医学院，北京100029；2.北京中医药大学第三附属医院，北京100029

睡眠质量下降常会影响人们的学习与工作，甚至会加重原有病情，继发其他症状。美国一项卫生经济学研究显示，失眠患者消耗的医疗资源是非失眠患者的12倍［1］。Johnson以社区人群为研究对象，发现约30%的个体声称6～12个月内有失眠经历［2］。世界卫生组织估计全球有将近7亿失眠患者［3］。最新研究发现睡眠与炎症免疫存在双向联系［4］。复发性口腔溃疡是失眠患者最常出现的症状之一［5］，睡眠剥夺会延缓创面的愈合，口疮引发的疼痛也会影响睡眠［6］。传统治疗基础上加以适当睡眠调节可促进黏膜修复［7］。睡眠与黏膜损伤关系密切，二者致病机理有待进一步探索。

中医诊疗不仅着眼于病的异同，更着眼于机体的差异，辨证可发现心肾不交的不寐与阴虚火旺的口疮均会出现潮热盗汗，舌红少苔，脉象细数等表现［8］，舌为心苗，心主神明，肾生髓，脑为髓海，足少阴经循喉咙夹舌本，络气别入膀胱经，上荣脑髓，虚火内生，上扰清窍是其病机，清心泻火，引火归元为其准则。黄连降心火，肉桂鼓肾精，药简而力专。交泰丸组方实际源自明代医易学家韩懋所著的《韩氏医通·药性裁成章》，其认为肉桂一钱以应“天一”，黄连六钱以应“地六”，意在天一生水，地六承之。改否卦为泰，故名交泰，书中仅提交泰之名，直至清代王士雄在创作《四科简效方》录入安神诸方时，才把方名确定下来，用于治疗怔忡不寐。近代医家不仅用其治疗传统的失眠抑郁［9］，更用其治疗糖尿病［10］、非酒精性脂肪肝［11］、围绝经期综合征［12］以及口腔溃疡［13］等。本文借助近年来逐渐成熟的网络药理学异病同治方法［14］探讨其有效机制。

1 材料与方法

1.1 交泰丸成分靶点的筛选与获取通过TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）［15］和SymMap（https：//www.bioinfo.org/symmap.）［16］等数据库寻找黄连与肉桂的成分，根据口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18两个参数进行初筛以获取有效成分及其靶点，并结合文献报道补充未预测到的信息。按服务器规定生成mol2格式文件，向SwissADME（http：//www。swissadme.ch/index.php）数据库输入上述文件计算小分子化合物理化性质，以支持检索发现。并利用Uniprot数据库（https：//www.uniprot.org）规范靶点名称，最后将中药靶点取并集，得到交泰丸总的作用靶点。见表1。

1.2失眠和口疮共有靶点的获取分别向OMIM（http：//omim.org/，updatein 2018-07-03）、Gencards（http：//www.genecards.org/，version 4.8.0）、Drugbank（https：//www.Drug bank.ca/，version 5.1.1）输入由Pubmed检索得来的Mesh术语，获得口疮基因靶点与失眠基因靶点。将两种疾病靶点取交集，就是失眠与口疮的共有靶点。

1.3 方剂-成分-靶点-疾病网络的构建把交泰丸总的作用靶点与口疮与失眠的共有靶点再取交集，就是交泰丸治疗口疮与失眠可以共同起效的位点。将上述方剂、药物成分、靶点与共有疾病作为节点，利用Cytoscape软件构建网络模型。

1.4 共有靶点网络分析将交泰丸治疗上述两种疾病的作用靶点导入String（https：//string-db.org/，version10.5）数据库中获取蛋白相互作用关系，并用Cytoscape软件绘制PPI网络。应用MCODE算法进行模块分析，cytoHubba插件筛选核心靶点，并把核心靶点分别导入DisGeNET（http：//www.disgenet.org，version 5.0）数据库中挖掘基因蛋白分类信息及其与疾病的联系。最后使用Metascape（http：//metascape.org/，version 3.0）富集平台，导入关键靶点，设置物种为人，进行GO分析和KEGG通路分析，根据P值大小进行排序，保留排名靠前的结果，借助bioinformatics平台绘制高级富集分析气泡图。

1.5 构建方剂成分-共病靶点-通路网络图运用CytoScape绘图工具构建交泰丸成分-共病靶点-通路网络图，分析Metascape富集分析参数，依据P值得到前15个核心通路，与上文遴选得到的活性成分靶点相关联，最终得到19个有效成分的69个基因靶点并制图。

2 结果

2.1 交泰丸治疗口疮与失眠共同起效的作用靶点的获取药物方面，通过检索TCMSP、Swisstarget等药学数据平台并结合文献报道补充未预测的化合物靶点，结果显示交泰丸中黄连有10个有效成分，355个靶点；肉桂有9个有效成分，183个靶点。两味中药搜索结果取并集，最终得到19个有效成分，456个靶点，标准化蛋白质靶点信息，校正为官方名称（official symbol）。

表1 交泰丸筛选得到的候选化合物

疾病方面，通过向OMIM、Gencards、Drugbank数据库输入由NCBI检索得来的医学专业术语insomnia进行查询，最终得到2622个失眠靶点。类似地通过向上述数据库输入Oral ulcer进行查询，可以得到4124个口疮靶点，然后将两种疾病的靶点取交集共得到813个共有靶点，就是导致两种疾病发生的共有靶点，同样，它也是药物精准治疗的位点。

第三步，将方剂总的靶点与疾病共有靶点取交集，就是交泰丸治疗以上两种疾病可能显效的位点，共有108个，创建思维导图。见图1。

图1 获取交泰丸“异病同治”关键靶点的思维导图

图2 交泰丸治疗失眠和口疮方剂-成分-靶点-共有疾病网络关系图

2.2 药物-成分-疾病网络构建将108个关键靶点导入Cytoscape中构建方剂-成分-靶点-共有疾病的系统网络，合并简化用于后续分析处理（图2）。共涉及129个节点，386条边。节点表示方剂、成分、靶点、共有疾病，边表示节点彼此的联系。形状设置为圆，其中六边形表示方剂、圆形表示黄连成分（10个）；V字形表示肉桂成分（9个）；菱形表示靶点（108个）；八边形表示共有疾病。度值越大，节点越大，颜色越深越重要。根据Network Analyzer拓扑运算结果，找出中心度值、亲中心度值、等级值均值筛选后交集靶点较高的10个gene symbol（ACHE、BCHE、CHRM1、ADRA2C、PARP1、AR、CYP2D6、F3、ESR1、PTGS1）。

2.3 共有靶点蛋白相互作用网络构建为进一步了解共有靶点的相互关系。将靶点导入String中获取PPI网络，并用Cytoscape绘制模型，节点表示蛋白，边表示相互作用关系。节点越大，颜色越深，度值越大越重要（图3）。网络共涉及107个节点，848条边，应用MCODE算法识别密集连接组件，Cluster Finding参数设置为Haircut，degree cutoff：2，Node score Cutoff：0.2，K-Core：2，Max.Depth：100，P<0.05表示差异有统计学意义，结果涉及6大模块（图4），用字母显示（K1，K2，K3，K4，K5，K6），最后根据度值用cytoHubba插件遴选出联系最紧密的10个横行霸道（AKT1、VEGFA、TLR4、ESR1、MMP9、DRD2、RELA、PIK3R1、MTOR、MAOA）。

图3 交泰丸治疗失眠和口疮共有靶点蛋白相互作用网络

2.4 共有靶点GO分析和KEGG通路分析将108个关键靶点输入到Metascape生物注释富集分析平台中，设定物种为人，对其进行基因本体分析和通路分析，发现基因靶点主要涉及一些神经内分泌递质有关的分子功能；作用场所为神经突触；血液循环、免疫炎症与体内激素的释放是其发挥生物学效应的必要环节，通路分析发现cAMP、HIF-1和Ca2+信号，糖尿病并发症中的AGE-RAGE通路［17］与疾病的进展联系紧密。上海宝山［18］的一项口腔黏膜疾病（OMD）与糖尿病抽样调查，可以佐证神经内分泌的紊乱是消化道黏膜损伤的独立危险因素。对P值进行排序，根据Analysis-Report保留数据，借助bioinformatics平台绘制气泡图（图5）。

图4 交泰丸治疗失眠和口疮共有靶点蛋白相互作用模块分析

2.5 交泰丸成分-共病靶点-通路网络图的构建运用CytoScape构建交泰丸成分-共病靶点-通路网络。通过Metascape平台，参照FINAL_GO文件中的P值，遴选前15个核心通路，然后与方剂有效活性成分靶点相关联，最终得到103个节点367条边的网络，基因节点均设置为圆形，肉桂成分为方形，黄连成分为三角形，通路为V字形；节点大小颜色透明度反映度数，节点越大颜色越深说明越重要。见图6。

图5 交泰丸治疗失眠和口疮共有靶点的KEGG通路分析、GO分析（细胞成分、分子功能与生物过程）的高级富集分析气泡图

表2 交泰丸治疗失眠与口疮的KEGG富集分析前15位通路

2.6 靶点蛋白归属与相关疾病将10个核心靶点导入DisGeNET中，获取蛋白归属信息，结果显示AKT1、PIK3R1、MTOR属 激 酶，VEGFA与 信 号 转 导 有 关，ESR1为核受体，MMP9属于酶，RELA属转录因子，其余未明。检索发现基因多与神经、免疫、消化系统与内分泌代谢疾病有关。AKT1与精神行为障碍有关（度值分数0.9），VEGFA与皮肤和结缔组织疾病有关（0.6），TLR4与糖尿病神经病和克罗恩病有关（0.51、0.5），ESR1与乳房恶性肿瘤有关（1），MMP9与胃溃疡有关（0.5），DRD2与情绪障碍精神抑郁有关（0.5），RELA与结肠炎有关（0.55），PIK3R1与胰岛素抵抗有关（0.6），MTOR与局灶性Ⅱ型皮质发育不良有关（0.74），MAOA与精神情绪有关（0.91），提示精神情志疾病，炎症免疫介导的消化道黏膜损伤与以上基因相关。

3 讨论

图6 交泰丸成分-共有疾病靶点-通路网络关系图

3.1 化合物与疾病通过检索化合物来源数据库检索交泰丸化合物成分发现，α-松节烯与GABA-苯二氮卓（BZD）受体直接结合，延长GABA能突触传递时程，在不影响非快动眼睡眠（NREMS）质量的情况下增强NREMS的数量，显示出增强睡眠的特性［19］。1-环己基二乙酸单酰胺为加巴喷丁的中间体，加巴喷丁结构与GABA类似，但不激动受体，对病理兴奋灶起到不同程度的抑制作用，快速恢复脑细胞的高级功能，维持神经内环境稳态，改善睡眠。棕榈油酸可预防SHRSP大鼠因脑血管疾病引起的死亡，在给予1%棕榈油酸的饮食后可显著提高其存活率，并且在摄入过量NaCl的情况下，中风发生率也不会升高，显示出强大的脑血管保护作用［20］。此外，还可调节下丘脑-垂体-肾上腺轴和单胺能通路来延缓动物模型肠易激综合征样胃肠功能障碍的发展。通过促进单胺氧化酶的氧化脱氨基，降低额前皮质和杏仁核中的5-羟色胺含量，对自主神经高级中枢和植物神经系统进行调节，减弱应激诱导的去甲肾上腺素的变化，增强大脑区域的防御功能，从而达到改善睡眠、防治神经衰弱的目的［21］。右旋龙脑极低剂量下即可对GABA受体Cl-电导产生高效的正调节作用，用于镇痛和麻醉［22］。表小檗碱为胆碱酯酶抑制剂，对阿尔茨海默病（AD）有潜在治疗作用［23］，一项有关睡眠调节与AD发病机制的研究表明，NREMS小幅增加可以改善小鼠模型中Aβ病理沉积从而缓解病情。黄藤素具有很强的吲哚胺-2，3-双加氧酶（IDO）抑制活性。体内研究可减少炎细胞浸润，抑制结肠MPO活性，防治结肠炎小鼠模型肠黏膜损伤，预防肠道菌群失调和调节色氨酸分解代谢［24］。以上化合物可通过改善脑供血，保护脑细胞，抑制神经冲动，降低机体对应激的敏感性，从而改善睡眠，患者只有心情舒畅，神经内分泌与免疫系统才能正常工作，炎症介质才可清除，黏膜溃疡才会早日愈合。

3.2 基因与疾病基因既是疾病发生的原因，也是药物作用的靶点，Hits栏中一些关键靶点，探讨交泰丸起效的药理机制。细胞色素P450酶系（CYP2D6）参与氧化多种化合物，如咖啡因的代谢，奥美拉唑硫氧化以及咪达唑仑的羟基化。刘要武等［25］认为黄连泻心火可能与降低尿儿茶酚胺有关，肉桂温肾阳可能与提高尿17羟皮质类固醇有关，测定以上指标不仅可以检测病情，同时也为心火亢盛，肾阳不足症状的治疗提供了思路。对部分患者应用交泰丸，以上指标均趋于正常，症状明显改善，可见该酶系可能在机体代谢方面发挥了重要作用。内源性大麻素受体介导许多复杂反应，包括饮食、记忆、焦虑、胃肠蠕动、慢性疼痛等，可能与下丘脑线粒体呼吸调节有关。该受体天然合成阿片类成分，包括芬太尼、丁丙诺啡和美沙酮等。激动剂与其结合可缓解焦虑抑郁的情绪，提高痛阈，改善睡眠［26］。AHR能调整生物钟，恢复人体正常节律，有利于免疫调节与损伤修复［27］。RAB7B负调控巨噬细胞中的TLR4信号传导，与脑功能相关。NO介导冠状血管中VEGF诱导的血管生成并可以改善肾小球的功能。ICAM蛋白是白细胞黏附蛋白LFA-1的配体，在白细胞跨内皮迁移过程中促进内皮细胞的组装与炎症反应的进程，其中IL-26可能在黏膜免疫的局部机制中起作用。PTGS1在胃上皮细胞和牙周疾病中起细胞保护作用［28］。MMP2参与组织修复。MPO通过PMN诱发，生理情况下即可催化次氯酸生成，这些中间体显著增强其杀菌活性。另有雌孕激素与消化道溃疡相关性的流行病学报道显示，女性患失眠与口疮的概率高于男性［29］。以上靶点的分子机制均提示了交泰丸不仅可以缓解紧张情绪，改善睡眠，同时还可以通过调节体内激素释放，从而介导免疫炎症促进黏膜损伤修复。

3.3 AGE-RAGE信号通路与疾病糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路可激活多个细胞内信号途径，可增强NF-κB活性，介导炎症因子IL-6及其受体亚基参与免疫调节和止痛信号的传导［30］。在糖尿病神经症状中，该通路加重了神经系统功能的紊乱和对疼痛的敏感性。而与失眠、口疮相关的多数靶点都有cAMP和Ca2+的参与，中医主张辨证论治与治病求本，交泰丸有利于改善诸如cAMP参与调节的许多生物进程，包括代谢、分泌、钙稳态等，最后是HIF-1信号通路与皮肤黏膜损伤有关，中药成分针对以上风险起效，比如消肿止痛，调节免疫，修复伤口，从而促进黏膜溃疡愈合，改善睡眠质量。

综上所述，古人用交泰丸治疗心肾不交的怔忡失眠，奉为圭臬，现将其应用到消化道黏膜损伤的治疗，收到良好的效果，这为方剂再开发提供了循证依据。网络药理学研究发现，交泰丸治疗失眠和口疮主要是通过改善中枢神经系统的血供，保护脑组织，调控突触递质的释放，从而减少不良刺激对机体的影响，使患者克服消极情绪，恢复神经内分泌的稳态，调节免疫，清除炎性介质，加速溃疡愈合，方剂配伍不仅协同增效，而且能够在抑制促炎细胞因子产生的情况下，保留其抗炎活性，在达到治疗疾病的同时，减少对机体的损伤。最后是通路基因靶点的高度拟合，提示其可能通过以上相似机制而显效。由此可见，交泰丸通过多成分、多靶点、多通路起到了异病同治的治疗效果。