板蓝根多糖在结核大鼠模型中对Th细胞的干预作用

田 冰 樊安莲 刘 璟

(1.重庆大学附属三峡医院感染科 重庆 404000；2.重庆三峡医药高等专科学校医学基础部免疫教研室重庆 404000)

结核病由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis， M T B）感染造成，近年结核罹患率上升，结核患者年轻化，结核治疗难度加大[1]。研究证实，结核病的病程与患者体内Th细胞漂移关系密切，结核病本身是感染、抗感染免疫和超敏反应的三位一体，其组织损伤多由病理性免疫反应造成，而临床治疗主要使用国标抗结核配伍，对免疫调节重视不足。目前国内有不少中药干预结核免疫的研究，如猫爪草、狼毒大戟等[2][3]，因中药干预具免疫调节机制而备受重视，但体内实验开展较少，缺乏相关经验可借鉴。板蓝根多糖是中药板蓝根提纯的多糖成分，近年研究显示其在感染、肿瘤等疾病中有突出的免疫调节效应[4][5]，故而本研究选定板蓝根多糖为干预药物。本研究建立结核大鼠模型，以症状评估及相应检查为标准，探讨板蓝根多糖应用于结核治疗的可行性。研究情况介绍如下。

一、资料和方法

（一）实验模型资料

健康SPF级大鼠60只，体重200（±20）克，购自成都达硕实验动物有限公司，许可证号SCXK(川)2013-24，各组间体重和性别差异无统计学意义，10只为对照组，50只大鼠经尾静脉接种标准菌株H37RV混悬液建造动物模型。

1.造模方法

参考吕艳文献[6]，将经大鼠体内接种毒力复苏的菌种转种改良罗氏培养基，37℃培养20天，取干菌落加灭菌生理盐水研磨成菌悬液，比浊法测定菌悬液浓度为3×107/ml，经尾静脉注射0.2ml菌悬液，接种前后常规喂养。

2.造模评估

根据卢振方等研究经验[7][8]，接种菌株后主要根据两方面情况评判造模结果：大鼠临床表现：1.临床症状：毛发脱落、进食减少、体重减轻、精神萎靡、活动度降低等；2.实验室检查：肺泡灌洗液查结核分枝杆菌阳性。

3.动物模型分组、干预处理及干预效果评估标准

根据造模标准判定造模成功40只，随机选其中10只设定为模型组，其余30只为干预组。干预组大鼠确认造模成功后分别予板蓝根多糖100mg.kg.d，200mg.kg.d，300mg.kg.d腹腔注射，观察三组大鼠临床表现，根据大鼠症状表现及造模评判，干预效果评估标准设置如下：进食（＞50g/d为正常，30～40/d为减弱，＜30g/d为严重。），精神状态（精神好，对刺激反应敏捷为正常，精神稍差，对刺激有反应为减弱，精神萎靡，刺激反应迟钝为严重），毛发情况（茂密无脱落为正常，少量脱落为减弱，大量脱落为严重），体重（变化＜5%为正常，5%＜变化＜10%为减弱，变化＞10%为严重），正常3分、减弱2分、严重1分，采取分数叠加制，10-12分为显效，6-9分为有效，3-5分为无效。造模成功后20天和30天各抽一次大鼠外周血，流式细胞术检测Th细胞亚群表型，ELISA法检测血清中IFN-γ、IL-4、IL-10。

（二）菌种、试剂及药品

结核分枝杆菌H37RV菌种由中国疾控中心重庆结核病预防控制分中心提供，-80℃低温保存，常规传代。ELISA试剂盒购自武汉华美科技有限公司，IFN-γ试剂盒（CSB-E04579r），IL-4试剂盒（CSB-E04634m），IL-10(CSB-E07451r)，严格按说明书低温保存并使用。板蓝根多糖由重庆三峡医药高等专科学校抗肿瘤天然药物研究工程中心自行提取，纯度为85%。超低温冰箱（海尔，DW-86L286)，电子天平（上海越平FA1004B），生物安全柜（苏州安泰，BSC-1000ⅡA2），酶标仪（芬兰，Multiskan MK3），流式细胞仪为贝克曼库尔特临床分析型三激光流式细胞仪DXFlex，显微镜用奥林巴斯显微镜CX31-LV320。

（三）大鼠肺指数测算

肺指数可表现出肺部炎症情况的严重程度，三组大鼠处死后，取出肺脏进行称重，按肺指数计算公式，肺指数=肺重量（g）×100/体重（g），计算得三组大鼠肺指数并进行比较。

（四）数据处理

症状比较用例数表示，肺指数、T细胞亚群及细胞因子检测数据以均数±标准差表示，干预组大鼠症状表现用卡方检验，肺指数比较用单因素方差分析，干预组肺指数组间比较用两两比较，T细胞亚群及细胞因子检测结果各组间数据比较用析因分析，析因设计统计组间差异性仍然要用方差分析，以P＜0.05差异有统计学意义。数据处理用统计学软件SPSS16.0。

二、结果

（一）三组大鼠症状表现

接种菌株之后，模型组和干预组大鼠于第8天左右出现毛发脱落、没有光泽，进食减少、体重减轻，活动度降低、精神状态差、给予刺激反应也比较慢。干预组大鼠经板蓝根多糖干预后，第20天和第30天测体重基本未再减轻，进食如常，毛发不再脱落，精神好，给予刺激反应正常。期间没有大鼠死亡。干预组大鼠模型中症状表现具体情况为300mg.kg.d组显效4例，有效6例，无无效案例，200mg.kg.d组显效4例，有效6例，无无效案例，100mg.kg.d组显效2例，有效8例，无无效案例。期间观察干预组大鼠治疗效果与干预剂量正相关（P＜0.01）。

（二）三组大鼠肺重量指数比较

三组大鼠处死后，取出肺脏进行称重，按公式计算得三组大鼠肺指数及比较情况，健康组大鼠肺指数为0.55±0.13，模型组大鼠肺指数3.59±1.12，100mg.kg.d组肺指数2.67±1.06，200mg.kg.d组肺指数2.14±0.72，200mg.kg.d组肺指数1.93±0.69，与健康对照组相比，干预组大鼠肺指数仍有升高，P＞0.05；与模型组相比，干预组大鼠肺指数明显降低P＜0.01；随给药剂量，干预组肺指数有所降低，组间两两对比，肺指数差异有统计学意义，P＜0.01。

（三）三组大鼠Th细胞表型及表达情况检测

三组大鼠外周血检查，对照组CD4 37.12±5.86，CD8 18.43±2.24，CD4/CD8 2.11±0.45；模型组CD4 20.27±5.08，CD8 21.45±2.46，CD4/CD8 1.13±0.31；经干预后，100mg.kg.d组CD4 32.69±6.23，CD8 19.59±2.22，CD4/CD8 1.72±0.22，200mg.kg.d组CD4 36.07±5.14，CD8 19.08±2.23，CD4/CD8 1.89±0.28，300mg.kg.d组CD4 36.42±5.22，CD8 18.82±2.34，CD4/CD8 1.94±0.29，干预组大鼠检测Th细胞亚群接近健康对照组，与模型组和对照组比较差异均具有统计学意义（P＜0.001）。

（四）三组大鼠细胞因子检测结果

干预组大鼠在造模成功20天开始出现IFN-γ、IL-10轻微降低，IL-4未明显降低，造模成功30天后，干预组大鼠外周血IFN-γ、IL-10明显降低，IL-4轻微降低，与模型组及对照组相比较差异均具有统计学意义（P＜0.001），数据如下表1。

表1 三组大鼠细胞因子检测结果（±s，pg/ml）

表1 三组大鼠细胞因子检测结果（±s，pg/ml）

lFN-γ lL-4 lL-10对照组101.57±5.33 50.16±4.82 31.96±4.39 20天61.15±4.88 75.31±6.07 80.84±5.71模型组30天61.37±4.92 75.42±6.21 81.97±5.44 20天81.79±5.62*69.67±5.99**50.16±5.77***100mg.kg.d组30天82.73±5.31*64.72±6.02**52.85±4.98***20天90.64±5.16*67.54±6.19**42.32±5.41***200mg.kg.d组30天95.13±5.67*63.49±6.18**41.56±4.62***20天96.67±5.17*66.69±6.18**40.73±5.33***300mg.kg.d组30天100.73±4.99*61.74±5.78**39.79±4.72***F 241.27 58.58 594.78 P 0.001 0.001 0.001

*F值59.35，P＜0.001，**F值8.33，P＜0.001，***F值30.30，P＜0.001。这三组数据的比较反映出板蓝根多糖干预效果与板蓝根多糖用量正相关。

（五）三组大鼠病理学检查结果

造模30天后处死大鼠，模型组大鼠病灶在镜下可见肺部基础结构破坏较严重，有干酪样坏死，大量炎细胞浸润，较多郎罕氏巨细胞和上皮样细胞，有典型结核结节；干预组大鼠镜下观肺部基础结构损伤较小，炎性浸润较轻，上皮样细胞减少而纤维母细胞增多。

三、讨论

结核病传播方式多样，侵犯部位多样，可通过结核分枝杆菌产生的脂类和蛋白类物质引起机体超敏反应，在结核病的病程中，感染、免疫和超敏反应是一个复杂的共同作用而又相互影响的整体效应。结核病的病理损伤也多因超敏反应及炎症损伤所致。研究证实，结核病病程与Th细胞漂移及Th细胞分泌的细胞因子密切相关。在近年来的研究中，板蓝根多糖在感染、肿瘤等疾病中有突出的免疫调节效应，故而选定为干预药物。鉴于此前研究缺少相关经验可借鉴，本研究大部分评估为根据治疗经验自行设置。

研究参照前人研究建立大鼠结核模型，以症状和影像学检查为造模判定标准，并设置症状表现评估标准。接种菌株后，大鼠于第8天左右开始出现不同程度进食、体重、精神状态的变化，结合预设判定标准，成功造模40只，成功率为80%。干预组大鼠确认造模成功后随机分三组，分别予板蓝根多糖100mg.kg.d，200mg.kg.d，300mg.kg.d治疗。在进行板蓝根多糖干预后20天左右，干预组大鼠体重逐渐稳定，精神状态也有所好转。继续观察至30天，根据预设症状评估标准，板蓝根多糖干预组大鼠症状较模型组大鼠缓解。病理检查显示，未经处理的模型组大鼠肺部基础结构破坏严重，大量炎细胞浸润，可见干酪样坏死和大量上皮样细胞、郎罕氏巨细胞，为典型结核结节，而经板蓝根多糖干预的大鼠肺部基础结构尚存在，炎性浸润较轻，上皮样细胞少而纤维母细胞多，显示病灶有纤维化趋势。结合症状表现评估和病理检查，说明板蓝根多糖在结核大鼠模型中可干预过度的炎症病程，减少肺组织炎性病理损伤，对结核干预有积极作用。

脏器感染MTB后，由于MTB的病理性炎症反应，脏器重量会增加，其重量与病理变化正相关。研究结果表明，在进行板蓝根多糖干预后，干预组大鼠肺重量指数较模型组大鼠小，虽然未恢复至正常，但已说明板蓝根多糖对MTB感染大鼠的病程有积极作用。

多数研究认为，结核免疫病程与Th细胞活化失衡及Th细胞漂移有关。Th细胞是人体免疫调节细胞的主力，主要靠分泌细胞因子发挥作用。IFN-γ主要由Th1细胞分泌，具活化巨噬细胞功能，可调节炎症免疫效应，是机体抗结核免疫中的关键因子。在既往研究中，证实由于Th细胞漂移，外周血IFN-γ在结核不同的病程期有不同的浓度，其浓度与活动性结核分枝杆菌数量有关。在本研究中，造模成功后，外周血CD4Th细胞降低，CD8T细胞轻微升高，CD4/CD8出现比例失衡，IFN-γ表达随之降低，符合前人研究。使用板蓝根多糖干预后，CD4Th细胞逐渐上升，CD8T逐渐接近健康对照组水平，CD4/CD8随之接近正常组，IFN-γ逐渐上升，其升高程度与干预药量正相关，结合症状评估结果，应当是板蓝根多糖干预了Th细胞的表型分化，恢复细胞免疫平衡，IFN-γ表达逐渐正常，促进巨噬细胞抗MTB，使结核病程得到控制，活动性MTB减少。IL-4、IL-10主要由Th2细胞分泌，可调节IFN-γ分泌和效应，避免结核病程中过度炎症反应造成的病理损伤，在结核病中具免疫保护作用。过低的IL-4被认为是结核严重炎症病理损伤的原因。在本研究中，干预组大鼠的IL-4、IL10在造模成功及造模成功后20天升高，在经干预后30天降低至接近正常水平，结合大鼠模型的症状表现和病理检查，可以认为在此次干预中，CD4/CD8保持在一个较合适的动态平衡中，既有利于结核的抗感染免疫，也可以起到避免病理损伤的作用。

四、结束语

板蓝根多糖可通过对Th细胞表型及细胞因子表达的影响，对结核病程进行免疫干预，减轻病程中病理性炎症反应，促进巨噬细胞的抗MTB作用，对结核病具积极作用。目前存在的问题是：板蓝根多糖在抗MTB的过程中是否具有量效关系还不够明确；板蓝根多糖与其他抗MTB的药物单独作用效果比较和协同作用效果尚未验证，还需进一步实验证明。