白藜芦醇抗切除卵巢大鼠发生骨质疏松的作用研究

游丽娟 葸慧荣 高玉海 杨芳芳 陈克明*

1.甘肃省妇幼保健院健康管理中心，甘肃 兰州 730050 2.联勤保障部队第九四○医院骨研所，甘肃 兰州 730050

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少、骨微结构破坏为特征的全身性骨骼疾病[1]。绝经后的妇女由于雌激素缺乏往往会发生骨丢失和骨质量下降现象从而引发骨折甚至死亡[2]，目前临床上关于OP的治疗主要采用西药双膦酸盐、甲状旁腺类等药物，长期服用价格昂贵、副作用大，因此，急需寻找副作用小、疗效好的中药替代药物从而降低用药成本[3]。

白藜芦醇是一种结构类似雌激素己烯雌酚的天然多酚类化合物，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物中[4]。研究显示，白藜芦醇在体外与雌激素竞争性结合雌激素受体，类似植物雌激素，发挥抗OP作用[5]。据报道，白藜芦醇可调节血脂，具有抗血小板聚集、抗氧化、抗肿瘤等诸多生物学活性[4-5]。淫羊藿苷是中草药淫羊藿的主要有效成分，诸多文献证明，淫羊藿苷具有稳定的抗OP作用，目前已有开发的淫羊藿总黄酮胶囊在我国上市用于治疗原发性OP[6-7]。虽然也有白藜芦醇对去卵巢大鼠发生OP影响报道，但这些文章大多发表于几年前，其评价手段不全面，仍缺乏综合系统性评价。本实验以去卵巢大鼠为OP模型，白藜芦醇为目标研究药物，淫羊藿苷为阳性对照药物，利用骨密度、生物力学、血清生化指标、骨形态计量检测等方法全面综合探讨白藜芦醇抗OP作用，以期能为中医药白藜芦醇更好地运用于临床OP的治疗提供依据。

1 主要仪器、试剂盒与药品

LUNAR Prodigy双能X线骨密度测量仪(GE公司，美国)，AG-IS生物力学万能试验机(岛津公司，日本)，SP1600硬组织切片机(LEICA公司，德国)，BX51倒置荧光显微镜(OLYMPUS，日本)；EPOCH酶标仪(伯腾仪器有限公司，美国)。骨钙素和抗酒石酸酸性磷酸酶试剂盒(IDS公司，丹麦，Lot分别为：AC-12F1，SB-TR102)；白藜芦醇(纯度≥98%，宝鸡辰光生物公司，中国，Lot：20140207)；淫羊藿苷(纯度≥98%，宝鸡辰光生物公司，中国，Lot：20170125-2)。

2 实验方法

2.1 实验分组与处理

6月龄SPF级Wistar雌性大鼠40只，购自中国农业科学研究院下属兰兽研实验动物中心(实验动物合格证号：SCXK(甘)2014-0006-152)。大鼠造模前按随机数字表法分为4组，每组10只，分别为假手术组(Sham)、去卵巢组(OVX)、淫羊藿苷组(I)及白藜芦醇组(R)。除Sham组切除卵巢体积相同脂肪外，其余各组均由背部行双侧卵巢摘除术。术后及时青霉素粉末涂抹伤口并肌肉注射青霉素消炎，后连续注射青霉素3 d继续消炎。休整1周后开始灌胃给药。I组给药剂量为25 mg/(kg·d)，R组给药剂量为8.4 mg/(kg·d)，Sham组和OVX组均给予等体积蒸馏水(1 mL/200 g)，灌胃剂量依据来源于前期实验[8]。灌胃时间为每周一至周六早上9:00～11:00，每天灌胃1次。每2周称1次大鼠体质量，并根据体质量对灌胃剂量进行微调整。每4周检测一次全身骨密度，待组间全身骨密度出现显著性差异，禁食禁水24 h后处死所有大鼠并取材。

2.2 骨密度检测

用10%水合氯醛3 mL/kg的剂量腹腔注射逐个麻醉大鼠，后放置于双能X线骨密度仪治疗床上检测全身骨密度值；大鼠处死后，将分离的右侧股骨和椎骨分别置于骨密度仪上检测其各自离体骨密度值。

2.3 生物力学检测

将分离的左侧股骨置于AG-IS万能试验机上进行三点弯曲试验，跨距16 mm，加载速度10 mm/min，计算机自动记录最大载荷和弹性模量的值。将分离的大鼠第5腰椎骨(L5)进行压缩实验，实验开始前将椎骨用2000目砂纸打磨成近似上下两平面平行的圆柱体，打磨后的样本垂直放于不锈钢金属平台正中央，逐渐加载压力，加载速度为2 mm/min，记录最大载荷和弹性模量的值。

2.4 血清生化指标分析

麻醉后的大鼠剥离腹主动脉抽取血样后在室温下静置30 min，然后5 000 r/min离心8 min，将上层血清分装于100 μL小管并做好分组标记，冻存于-80 ℃待检测。采用骨钙素(osteocalcin，OC)、酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)ELISA试剂盒分别检测血清OC和TRACP-5b的OD值，按说明书制作各自标准曲线并计算出各自的浓度，单位分别为ng/mL和U/L。

2.5 骨形态计量学分析

新鲜分离的左侧胫骨用4%多聚甲醛固定后4周后，每组取6只软骨组织剥离完整的胫骨，切取带近心干骺端1.5 cm骨组织，用树脂包埋于直径为2 cm高度为8 cm的玻璃瓶中。待树脂冷却凝固后取出包埋块置于LEICA SP1600锯式切片机切成约50 μm的骨片，封固，砂纸打磨，然后进行品红-苦味酸(van gilson，VG)染色，用IPP6.0软件分析系统选择各组图片并导入软件，并根据图片分辨率选择对应标尺，后运用测量工具中长度、面积、颜色等选取功能分析骨小梁相关参数，包括Tb.N、Tb.Th、Tb.SP和BV/TV等，并观察骨组织形态结构。

3 实验结果

3.1 对大鼠体质量及器官指数的影响

实验期间大鼠正常进水进食，精神状态良好。如图1所示，随时间变化大鼠体质量变化不大，组间差异无统计学意义(P>0.05)。如图2所示，各组间大鼠的肝、脾、肺、肾的器官指数均无统计学差异。OVX组大鼠子宫系数显著低于Sham组(P<0.05)，I组和R组子宫系数显著高于OVX组(P<0.05)。子宫组间差异说明大鼠切除卵巢后由于雌激素缺乏，子宫发生萎缩，子宫系数降低，而I和R组均可抑制此作用的发生。

图1 各组大鼠体质量变化曲线Fig.1 The changing curve of the body weight of rats

图2 各组大鼠主要脏器的器官指数Fig.2 The organ index of main organs in rats注：与Sham组比较，*P<0.05，**P<0.01；与OVX组比较，#P<0.05，##P<0.01。

3.2 对大鼠骨密度的影响

如表1所示，4周全身骨密度结果显示，各组间骨密度变化不大，差异无统计学意义(P>0.05)；8周全身骨密度结果显示，与Sham组相比，OVX组大鼠全身骨密度值显著降低，差异具有统计学意义(P<0.01)；与OVX组相比，I组、R组全身骨密度均显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)。如表2所示，通过检测椎骨和左侧股骨骨密度，结果呈现与全身骨密度相同的趋势(P<0.01)。R组与I组差异无统计学意义(P>0.05)，只是平均值略低于I组，这一结果表明R可预防骨密度丢失。

表1 各组大鼠全身骨密度检测结果

表 2 各组大鼠离体骨密度检测结果

3.3 对大鼠生物力学的影响

如表3、4所示，OVX组与Sham组相比，大鼠股骨、椎骨的最大载荷和弹性模量均显著降低(P<0.01)；I、R组与OVX组相比，股骨、椎骨的最大载荷、弹性模量均显著增加(P<0.01)。I与R相比，差异无统计学意义。这一结果表明去卵巢后大鼠的生物力学性能下降，而I和R组都能抑制这一下降趋势。R组与I组差异无统计学意义(P>0.05)，平均值略低于I组，说明R也可增加去势大鼠生物力学性能。

表 3 各组大鼠股骨三点弯曲实验结果

表4 实验大鼠椎骨压缩试验结果Table 4 The compression test results of the vertebrae

3.4 对大鼠血清生化指标的影响

如表5所示，OVX组与Sham组相比，血清中OC含量降低而TRACP-5b含量增加(P<0.01)；I、R组与OVX组相比，OC含量均显著增加而TRACP-5b含量均显著下降(P<0.01)。这一结果表明I、R组都可通过促进骨形成抑制骨吸收来预防切除卵巢引起的骨丢失。I和R组差异无统计学意义(P>0.05)，只是平均值略低于I组，说明R也可改变骨形成和骨吸收相关的分子机制。

表5 大鼠血清中OC、TRACP-5b含量

3.5 对大鼠骨形态计量学的影响

如图3所示，OVX组与Sham组相比，骨小梁数量和致密性明显降低，且骨小梁分离度明显变宽；I组、R组与OVX组相比，骨小梁数量、网状交联度明显增加，骨小梁分离度明显减小，连续性好。I与R肉眼识别无明显差别。这一结果表明，I、R药物均可通过提高骨组织密度而增加骨质量。如表6所示，OVX与Sham组相比，其骨小梁数量和面积百分比明显降低而骨小梁分离度明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)；I组和R组与OVX相比，其其骨小梁数量和面积百分比明显升高而骨小梁分离度明显降低，差异也有统计学意义(P<0.05)。R与I相比，各指标相差不大，无统计学意义(P>0.05)。

图3 不同干预组大鼠胫骨近心干骺端骨组织形态学比较(40×)Fig.3 Morphological comparison of proximal tibial metaphysis among different intervention groups (40×)

表6 各组大鼠胫骨近心干骺端组织计量学静态参数比较Table 6 Histomorphometric indices in the proximal tibia metaphysis of rats

4 讨论

OP作为一种老年性疾病，绝经后妇女是主要分布人群常常会因骨质量严重下降丧失生活自理能力甚至缩短寿命，这给国家及家庭财力、人力造成了巨大的负担[9]。雌激素被认为是治疗绝经后OP最有效的药物。但使用雌激素后会引起一系列副作用，如乳腺癌、子宫内膜癌、心血管等疾病的发生等[10]。淫羊藿苷作为阳性对照药物，其来源于中草药淫羊藿，以其为主要成分开发的淫羊藿苷总黄酮胶囊早已在我国南方上市，但其原料药物的稀缺目前仍不能在全国普及。寻找能代替雌激素的更多中草药以此降低用药成本及副作用无疑会给广大OP患者带来福音。OVX大鼠模型很好地模拟了绝经后妇女的OP模型，是OP研究的经典动物模型，目前最为常用。

根据以往经验，卵巢摘除后的大鼠其进食量会明显增加，本研究统一进行了饮食的控制，排除饮食对其骨密度的影响，根据体质量结果显示，各组间体质量无显著性差异。但卵巢摘除后，正常情况下由于雌激素缺乏造成子宫萎缩，如OVX子宫系数所示，与Sham组具有显著差异。当药物治疗后，发挥了类雌激素的作用，其萎缩程度得到大量缓解，如I组和R组所示，与OVX相比，其差异有统计学意义。

本实验中OVX组8周后全身及离体骨密度、生物力学性能均显著低于假手术组。这表明卵巢摘除后机体不能产生雌激素从而导致其骨质量和骨强度明显下降，骨流失严重。血清生化指标检测发现其骨形成降低而骨吸收增加，进一步从分子水平进行了佐证。骨形态计量学的观察和静态参数的测量分析，确证了OP模型的成立。

骨密度是骨质量检测的黄金指标，通过骨密度检测可以直观判定骨质量的好坏[11]。骨密度结果显示，药物灌胃8周后I组和R组其全身骨密度、离体股骨和椎骨骨密度也有显著增加，说明I和R均可以预防因卵巢切除而引起的骨丢失作用。I组作为阳性对照平均值略微高于R组，但几乎无区别，说明R也能预防OP模型大鼠的骨密度的丢失，从而增加骨质量。骨的微结构和几何形态决定骨的力学性能，不受大小和形状的影响，它反映了骨的韧性和强度[12]。骨生物力学结果显示，R组股骨和椎骨最大载荷均显著高于OVX组，也再一次验证了此药物对增加OVX大鼠骨强度的显著影响。血清生化指标反映的是骨代谢的本质，是骨形成和骨吸收的直观反映，能客观地评价骨转换率[13]。血清骨代谢生化指标较模型组而言，骨形成因子骨钙素活性水平显著提高，骨吸收因子抗酒石酸酸性磷酸酶活性水平显著下降，表明R可通过增加OVX大鼠骨骨形成的活性且抑制破骨细胞的活性从而抑制了骨质的流失。骨形态计量学是评价骨组织微结构的重要指标，反映机体组织形态学的变化情况。本实验通过品红-苦味酸染色客观反映了各组间骨组织形态学的变化。结果显示，OVX组由于卵巢切除，其骨小梁数量和致密度较Sham组显著降低，而药物治疗后的R组骨小梁数量明显增加，网状结构致密，说明药物对其骨量有显著增加的影响。通过骨形态计量学静态参数的分析比较，R组大鼠较OVX组在Tb.N、Tb.SP以及BV/TV数值上均有明显增加的结果，再次验证了R可通过改善骨组织、增加骨密度从而提高骨质量。数据中Tb.Th只是平均值有增加，但统计结果无意义，也有增加的趋势。可能是因为其用药时间并未达到较为理想的效果。各项指标I组和R组相比，均无统计学意义，说明R可作为中药替代药物治疗骨质疏松，且其作用效果不次于公认骨质疏松治疗药物淫羊藿苷。

综上所述，R可通过提高大鼠骨密度、改变生物力学性能，增加骨形成的同时降低骨吸收，增加骨组织致密结构来抑制切卵巢大鼠的骨量流失。但仍有诸多问题需进一步研究，比如延长R用药是否效果更为理想还是作用效果消失？R药物作用的具体分子机制是什么？R药物的毒理实验等还有待进一步研究。但该研究结果为OP治疗寻找替代中药提供了理论依据，从而为更多更好的中药治疗OP研究和临床推广奠定基础。