精子DNA碎片指数在男性生育力评估及其疗效监测中的应用*

伍细言，彭新华，胡子文，禹虹，范烺（湖南省妇幼保健院生殖医学中心，长沙410008）

男性不育指男女双方未采取任何避孕措施，性生活正常，1年及以上女方未受孕。男性不育原因错综复杂，现有的男科实验室无法检测精子亚细胞形态的微小损伤，精子DNA碎片指数（DNA fragmentation index，DFI）能从精子DNA层面评价精子质量，被认为是一种评价精液质量和预测男性生育能力的有效指标［1］。精子DFI与精子产生过程中染色体异常组装、精子的氧化应激损伤或凋亡等有关［2］。研究表明，男性精子DNA损伤的增加，不仅会导致男性不育，亦可能影响胚胎发育，导致反复流产或出生缺陷增加、子代染色体异常的风险增加，甚至还会影响体外受精（in vitro fertilization，IVF）的结局［3-4］。本研究回顾性分析精子DFI数据，探讨精子DFI在评估男性生育力及监测抗氧化药物对高精子DFI男性不育患者疗效中的应用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2017年2月至2019年7月于我院就诊的2 122例男性患者。（1）正常生育组（62例）：夫妻双方在我院行孕前检查，双方检查结果正常，并排除其他全身性疾病，电话回访女方在1年内怀孕并正常生育的男性。（2）女方复发性流产的不育组（61例）：夫妻双方染色体正常，女方先兆流产及习惯性流产＞2次，于我院查因的男性；（3）不育行IVF组（1 999例）：因单纯男性不育因素行IVF的男性，或因女性单纯的输卵管或盆腔因素且女性年龄＜40岁行IVF的男性。根据精子DFI检测结果，不育行IVF组中430例高精子DFI（＞15%）男性进行了抗氧化治疗。

1.2 主要仪器与试剂 FACS Calibur流式细胞仪（BD公司）；人类精子核完整性染色试剂盒（浙江星博生物科技公司）。

1.3 标本采集与DFI检测 患者禁欲2～7 d后手淫法收集完整的精液于干燥取精杯内，于当天或冻存于-20℃冰箱解冻后在流式细胞仪上采用精子染色质结构分析法（sperm chromatin structure assay，SCSA）检测精子DFI。SCSA被认为是检测精子DNA损伤的金标准［5］。其原理是：受损的精子DNA在酸的作用下变性形成单链，而正常精子DNA维持双链。吖啶橙（AO）与双链DNA结合发出绿色荧光，而与单链DNA结合发出黄色或红色荧光。精子经AO染色后用流式细胞仪进行分析。具体操作为：取适量精液用样本稀释液（A液）稀释至100μL，使精子终浓度为（1～2）×106/mL；加入200μL酸溶液（B液，置于冰上操作），准确计时30 s之后，加入600μL吖啶橙染色液（C液）染色5 min，用流式细胞仪分析。每份标本至少计数5 000个精子，流式细胞仪经软件分析后自动给出每份标本的精子DFI值。430例高精子DFI（＞15%）男性进行抗氧化药物治疗。治疗方法：口服天然维生素E，每天3次，每次100 mg，规范治疗3个月。

1.5 统计学分析 用SPSS25.0统计软件进行。先用Kolmogorov-Smirnova和Shapiro-Wilk法检验数据分布状态，呈偏态分布的数据用中位数（四分位数间距）［M（IQR）］表示。采用Kruskal-Wallis H检验分析三组间精子DFI值的差异性，两两比较用Nemenyi检验。抗氧化药物治疗效果观察用Fisher分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组精子DFI结果比较 正常生育组、女方复发性流产的不育组及不育行IVF组精子DFI结果差异有统计学意义（H=18.050，P＜0.01）；两两比较显示，不育行IVF组男性精子DFI高于正常生育组（χ2=-4.017，P＜0.01）。见表1。

表1 正常生育组、女方复发性流产的不育组及不育行IVF组精子DFI结果比较

2.2 抗氧化药物对精子DFI的治疗效果 430例高精子DFI男性抗氧化药物治疗前后精子DFI值的变化见表2，高精子DFI男性进行抗氧化药物治疗后精子DFI下降。

表2 抗氧化药物治疗前后精子DFI值的比较

3 讨论

精子DFI检测作为精液常规检查的重要补充，目前已在临床实验室常规开展。研究表明，精子DFI与精液常规参数存在一定的相关性［6］，精液常规只能初步反映精子质量，而精子DFI能够从分子层面反映精子DNA的完整性。精子DFI增高，可反映男性生育力降低，同时增加女方复发性流产风险，影响IVF助孕结局［7-9］。而年龄、泌尿生殖道感染、生活方式、环境污染物等多种因素都可以引起男性精子DFI增高［10］。研究表明，正常生育组、复发性流产组及不育行IVF组间男性精子DFI存在差异，且不育行IVF组的精子DFI高于正常生育组，而复发性流产组的男性精子DFI介于正常生育组和不育行IVF组间，表明精子DFI增高与复发性流产和男性生育力降低密切相关。

引起复发性流产的因素复杂，有遗传因素、子宫病变、内分泌失调、自身免疫病等，其中还有近50%原因不明。研究显示，男性精子DFI增高可能是不明原因复发性流产的重要因素［7］。本研究亦显示，复发性流产组的男性精子DFI高于正常生育组，但未达到显著差异水平。这可能与本研究纳入的复发性流产组未剔除女方因素有关。但此结果也提示，复发性流产夫妇在临床诊治中应重视男性因素，尤其是精子DNA完整性的影响。

本研究中的不育行IVF组以男性因素为主，其精子DFI高于正常生育组，再次佐证了精子DFI可以用于评估男性生育力，且高精子DFI患者应该进行相应的治疗。

研究表明，氧化应激反应是导致精子质量下降及精子DNA损伤的重要因素。1979年，Jones等［11］首先提出，人类精子对氧化应激特别敏感，精子暴露于过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）分子环境中，可导致精子细胞膜结构受损，引起两种严重的“连锁反应”：一方面，促进精子细胞的凋亡过程，引起精子细胞核碎裂，核DNA碎片增多；另一方面，导致精子核DNA直接暴露于精浆中的ROS类物质中，精子DNA遭受ROS的正面攻击而引起大范围的DNA双链的断裂破坏，引起精子遗传物质结构受损、功能缺陷而导致男性不育。

虽然有大量研究致力于改善精子DFI，但是目前尚无明确的治疗指南。大量研究结果显示［12-15］，应用抗氧化药物对于体内过多氧自由基导致的氧化应激反应具有十分明显的抑制效果，可以有效保护精子DNA及相关功能。但抗氧化治疗是否显著降低精子DFI，相关研究较少。在我们的临床诊疗中，对高精子DFI患者多通过如下综合措施进行治疗，包括：（1）调整不健康的生活习惯：包括改变久坐、熬夜、缺少锻炼、抽烟、喝酒等不良生活方式。（2）服用抗氧化药物如维生素E、维生素C、葡萄糖酸锌、辅酶Q10等。结果显示，68.8%的病例经综合治疗后精子DFI均有不同程度的下降，提示抗氧化治疗能在一定程度上改善精子DFI。另有31.2%的男性精子DFI无改善，可能与患者依从性差或其他未知因素有关，未来我们需要进一步查找引起精子DFI增高的潜在因素。总之，精子DFI可在一定程度上反映男性生育能力，而对高精子DFI患者通过服用抗氧化药物，加强宣教，改变不良习惯，可以有效降低男性精子DFI，并最终改善妊娠结局。