粗毛豚草素生物合成途径研究进展

叶子煜，张 翔，朱睿睿，谢国勇，赵玉成，秦民坚

(中国药科大学 中药学院，江苏 南京 211198)

粗毛豚草素又称高车前素(Hispidulin)，是一种天然的类黄酮化合物，能够通过诱导细胞凋亡、抑制细胞周期、影响血管生成和转移来抑制癌细胞的生长，已成为预防和治疗癌症的一种重要补充药物[1]。癌症是世界范围内的一个重要的公共健康问题，据估计，到2050年癌症死亡人数将增加到1750万[2]，对癌症药物的需求也将急剧增加。虽然粗毛豚草素广泛存在于多种中草药，但是由于药用植物来源受地域、季节、自然环境等因素的限制，且粗毛豚草素在植物中含量较低，天然来源的粗毛豚草素无法满足临床上日益增长的需求。研究人员也试图开发粗毛豚草素的化学合成方法，却由于其可行性和产率较低，一直没有取得理想的效果[3-8]。因此，代谢工程成为提高粗毛豚草素产量的理想手段之一。本研究对粗毛豚草素生物合成途径及相关酶基因的研究进展进行综述，为进一步利用代谢工程生产粗毛豚草素或提高其产量提供理论基础。

1 粗毛豚草素的合成

1.1 粗毛豚草素

粗毛豚草素(4′,5,7-三羟基-6-甲氧基黄酮)是天然存在的多酚类化合物，在植物界分布广泛，主要分布于菊科、唇形科、马鞭草科、玄参科和鸢尾科植物的地上部分，如荔枝草(Salviaplebeia)、迷迭香(Rosmarinusofficinalis)、新疆雪莲(Saussureainvolucrate)[9]。近年来，粗毛豚草素因其广泛的生物活性受到了国内外学者的高度重视，包括抗炎、抗菌、抗骨质疏松，尤其是抗癌活性[5]。大量研究表明，粗毛豚草素对结肠癌[10]、卵巢癌[11]、胃癌[12]、胆囊癌[13]、肾癌[14]、肝细胞癌[15]等多种人类癌细胞系都有较好的活性。另外，粗毛豚草素与多种抗癌药物联合使用可显著增强抗癌药物对癌细胞的细胞毒性[13,16]。

1.2 粗毛豚草素的化学合成

为了获得更多粗毛豚草素，已有文献报道了一些合成方法。一种是通过保护黄芩素C-7位和C-4′位上的羟基，使C-6位羟基发生甲基化从而形成粗毛豚草素[3,4,7]，另一种是从简单的原料2,4,6-三羟基苯乙酮或2,4,6-三羟基苯甲醛出发，通过底物设计合成粗毛豚草素[5,8,17]。但是无论采用哪一种方法都无法实现粗毛豚草素的大规模制备。一方面是因为从植物中分离纯化黄芩素的过程十分繁琐，另一方面是因为合成过程中羟基选择性保护和脱保护效果不佳，同时化学合成常常伴随着高能耗和环境污染。因此，很有必要开发如代谢工程这种更经济有效的生产粗毛豚草素的方法。

1.3 粗毛豚草素的生物合成

类黄酮化合物是一类广泛存在于植物中的重要次生代谢物，已通过遗传学、生物化学和分子生物学等途径在拟南芥(Arabidopsisthaliana)、黄芩(Scutellariabaicalensis)、玉米(ZeamaysL.)、红花(CarthamustinctoriusL.)等多种植物中得到了广泛的研究。粗毛豚草素是植物类黄酮生物合成途径的产物，位于苯丙素生物合成途径的下游。苯丙素生物合成途径是植物最重要的次生代谢途径之一，一切含苯丙烷骨架的化合物都由该途径直接或间接形成，其下游支路的产物类黄酮化合物在植物繁殖和发育的调控中发挥作用，并作为生物环境的信号分子参与抵御各种生物和非生物胁迫[18]。如图1所示，苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase, PAL)是烟草中生产苯丙素化合物的限速酶[19]，由初生代谢产物苯丙氨酸(Phenylalanine)生成次生代谢产物的关键酶，也是催化粗毛豚草素合成的第一个酶。PAL通过非氧化脱氨反应将苯丙氨酸变成肉桂酸(Cinnamic acid)，且催化过程中不需要辅助因子的参与。随后肉桂酸在肉桂酸4-羟化酶(Cinnamate 4-hydroxylase, C4H)和4-香豆酰辅酶A连接酶(4-Coumarate:coenzyme A ligase, 4CL)的作用下生成查尔酮合成酶(Chalcone synthase, CHS)的前体化合物——4-香豆酰辅酶A(4-Coumaroyl-CoA)。查尔酮合酶是黄酮类化合物合成的起始酶，其产物柚皮素查尔酮(Naringenin chalcone)通过查尔酮异构酶(Chalcone isomerase, CHI)转化为二氢黄酮-柚皮素(Naringenin)，随后在黄酮合成酶(Flavone synthase, FNS)的作用下生成黄酮芹菜素(Apigenin)。芹菜素是一种常见的膳食类黄酮，已被证明对多种癌细胞系具有生长抑制作用[20]，在黄酮6-羟化酶(Flavone 6-hydroxylase, F6H)和黄酮6-O-甲基转移酶(Flavone 6-O-methyltransferase, F6OMT)的作用下芹菜素最终被转化为粗毛豚草素。此外，Kyndt等人于2002年首次从荚膜红细菌(Rhodobactercapsulatus)中发现的微生物酪氨酸解氨酶(Tyrosine ammonia-lyase, TAL)，能够将酪氨酸(Tyrosine)直接转化为4-香豆酸(4-Coumaric acid)[21]，因其步骤简单、效率高常被应用于工程菌中生产次生代谢物。

虽然我们根据不同物种中类黄酮的生物合成途径推测了参与粗毛豚草素生物合成的全部基因，但是目前该化合物在植物体中完整的生物合成过程还没有被报道。因此对该途径中相关酶基因的研究进展进行汇总比较，不仅有利于研究粗毛豚草素在植物体中的生物合成过程，更能够进一步为利用代谢工程生产粗毛豚草素或提高其产量提供理论基础。

2 粗毛豚草素生物合成相关基因

随着分子生物学技术的迅猛发展，药用植物的活性成分及其生物合成途径的基因研究已引起越来越多国内外学者的关注。目前已经在拟南芥、芹菜、黄芩等植物中发现了柚皮素、芹菜素、野黄芩素等前体化合物的生物合成途径，编码该途径的PAL、CHS、FNS等酶的基因也被充分鉴定出来，利用生物和非生物胁迫以及代谢工程来调控这些基因的表达水平可以直接影响特定代谢物的产生和含量的变化。

2.1 苯丙氨酸解氨酶(PAL)和酪氨酸解氨酶(TAL)

PAL是粗毛豚草素合成的首个启动酶和限速酶，其发挥功能的主要区域为丙氨酸-丝氨酸-甘氨酸(Ala-Ser-Gly)组成的活性位点(MIO)[22]。自1961年首次从大麦(HordeumvulgareL.)中分离出PAL蛋白[23]，迄今为止PAL已被证明广泛存在于单子叶植物、双子叶植物以及裸子植物中。不同植物中PAL基因的数量差异很大，虎眼万年青(Ornithogalumcaudatum)和覆盆子(RubusidaeusL.)中仅发现了两条PAL基因[24-25]，而水稻(OryzasativaL.)基因组包含了9个PAL基因[26]，玉米中PAL基因更是高达20条[27]。但是在粗毛豚草素分布最广泛的矢车菊属(Centaurea)、大翅蓟属(Onopordon)和鼠尾草属(Salvia)植物中并没有很多关于PAL的报道。与PAL不同，TAL广泛分布于微生物中，虽然玉米中的PAL已被证明能够同时催化苯丙氨酸和酪氨酸进行脱氨[28]，高等植物中还是很少有TAL的存在。TAL以组氨酸(His-89)残基为单一的活性位点，负责与酪氨酸反应。研究表明，用苯丙氨酸(Phe)取代其活性位点，可以将其底物选择性从酪氨酸转变为苯丙氨酸，从而转化为高活性的PAL，当PAL发生相应突变时，PAL也可获得相应的TAL活性[29]。

图1 粗毛豚草素可能的生物合成途径Fig. 1 The possible biosynthetic pathway of hispidulin

在高等植物中，PAL表达水平的变化是控制苯丙素生物合成的关键因素[30]。在水母雪莲花(Saussureamedusa)中，谷胱甘肽和茉莉酸甲酯能够通过诱导PAL的活性提高悬浮培养细胞中粗毛豚草素的含量[31,32]。在大豆(Glycinemax)中，病原体可以通过PAL途径诱导水杨酸的生物合成[33]。作为连接初生代谢物和次生代谢物的关键酶，PALs和TALs也被广泛应用于异源宿主中生产含苯丙烷骨架的化合物。但是由于参与4-香豆酸合成的C4H(肉桂酸4-羟化酶)需要与内质网膜结合，不利于在大肠杆菌等原核生物中进行活性表达，因此TAL常常作为C-4′位有羟基的黄酮类化合物合成的起始酶[34]。Kawai等人将类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的TAL(RsTAL)构建到变铅青链霉菌(Streptomyceslividans)中，使其能够以培养基中的葡萄糖或纤维二糖为碳源生产4-香豆酸[35]。Tantong等人的研究表明，表达了TAL的集胞藻(Synechocystis)PCC 6803在Ptrc1O启动子的作用下能够显著提高4-香豆酸的产量，且培养基中酪氨酸浓度为0.5 mM时其转化率最高[36]。

2.2 查尔酮合成酶(CHS)

CHS是类黄酮途径的起始酶，是第一个被发现的Ⅲ型植物聚酮合酶(Polyketide synthases, PKS)，负责催化一系列脱羧、缩合和环化反应。自1983年Reimold等人率先从培养的欧芹(Petroselinumcrispum)细胞中分离出第一个具有代表性的CHS基因之后[37]，已分离出近20个功能不同的CHS超家族，并对其进行了鉴定[38]。目前，除了金鱼草(AntirrhinummajusL.)和距花山姜(AlpiniacalcarataRoscoe)中的CHS基因含有两个内含子，虎杖(ReynoutriajaponicaHoutt.)中的一个CHS基因含有3个内含子外，大多数植物CHS基因在保守位置均为两个外显子包含一个内含子，该内含子大多长度不等，但多位于第65位半胱氨酸(Cys)密码子的A、C碱基之间，两个外显子分别编码60和340个左右的氨基酸，在进化过程中相对保守[39-42]。CHS为同型二聚体，每个单体都有深藏在其内部的活性位点，而保守的三元催化残基(Cys-164, His-303, Asn-336)则位于其顶部。在催化过程中Cys-164是亲核反应的活性位点和聚酮中间体的附着位点，而His-303和Asn-336在丙二酰辅酶A的脱羧作用中发挥重要作用。其他保守的CHS残基(Phe-216)可能在聚酮链增长的过程中有助于底物在活性位点的定位[43]。除了4-香豆酰辅酶A之外，来自紫苜蓿(Medicagosativa)的CHS还能接受阿魏酰辅酶A、苯乙酰辅酶A、苯甲酰辅酶A、丁基辅酶A等辅酶A连接的硫酯化合物作为底物[44]。

CHS主要在花中表达，通过异构化和官能团的替换影响黄酮醇、黄酮和花青素的合成，从而改变叶、花和果实的颜色[45]，其表达水平既可以被紫外诱导，也能够响应植物病原体、诱导子以及不同部位伤害的胁迫，从而提高黄酮类化合物的产量[43]。Chen等人在烟草中过表达CHS不仅提高了下游黄酮类化合物的产量，还提高了对盐胁迫的抵抗力[46]。刘秀明等人从红花中分离出了与水母雪莲花亲缘关系最近的CHS，并在拟南芥中进行过表达，也获得了高黄酮含量的转基因拟南芥植株[47]。Ali等人用10-5M的水杨酸处理姜(ZingiberofficinaleRoscoe)后可提高CHS 的活性，从而显著提高了柚皮素的含量，奇怪的是芹菜素的含量却显著降低[48]。这可能与先前研究发现的芹菜素在体外对黑麦(SecalecerealeL.)CHS有明显的抑制作用有关[49]。虽然还没有直接证据表明这种抑制作用也在体内发生，但似乎黄酮类化合物在细胞质中会积累到阻止CHS活性的水平，从而避免代谢物对植物的毒性作用[50]。CHS是形成中心代谢物柚皮素的关键酶，而柚皮素是合成粗毛豚草素的关键中间体。目前在利用微生物将芳香族化合物转化为柚皮素的研究中，柚皮素的生物合成多数是依靠来自不同植物或细菌功能基因的重组表达[51-52]。而维持供体特异性蛋白-蛋白相互作用可以改善途径动力学和特异性的假设表明，同一来源的基因的异源共表达有利于柚皮素的产生[53]。如图2所示，Koopman等人构建了来自单一物种拟南芥中柚皮素生物合成相关基因的表达谱，从中选择了最优基因导入酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，并对该工程菌进行改造及优化，首次实现了以葡萄糖为唯一碳源生产超过400 μM的柚皮素[54]。该菌株通过减轻酵母3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸(DAHP)合成酶的反馈抑制作用增加了苯丙氨酸的合成，并通过消除竞争性苯丙酮酸脱羧酶的活性减少副产物的形成，是生产粗毛豚草素的理想平台。

2.3 黄酮合成酶(FNS)

FNS通过在底物黄烷酮的C-2和C-3之间引入双键来形成黄酮化合物，分为FNS Ⅰ和FNS Ⅱ两种类型。FNS Ⅰ为可溶性Fe2+/2-酮戊二酸依赖型双加氧酶(2-ODD)，与黄烷酮3-羟化酶(Flavanone 3-hydroxylase, F3H)、黄酮醇合成酶(Flavonol synthase, FLS)和花青素合成酶(Anthocyanidin synthase, ANS)等2-ODD家族其他酶的同源性较高，都有两个相同的保守结构域(DIOX_N和2OG-Fell_Oxy)，因此仅从蛋白序列上很难进行区分[55]。FNS Ⅰ于1981年首次被发现于伞形科植物欧芹，随后定点突变结果表明该FNS Ⅰ很可能是F3H演变而来，在FNS Ⅰ被发现于水稻、玉米等单子叶植物之前，FNS Ⅰ一直被认为是伞形科植物所特有的[56]。与FNS Ⅰ不同，FNS Ⅱ为依赖分子氧和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的细胞色素P450单加氧酶，是一种膜结合蛋白，在含有黄酮类代谢物的植物中分布广泛。所有已表征的FNS Ⅱ酶都属于P450 CYP93家族，大部分FNS Ⅱ可以直接将黄烷酮转化为黄酮，没有任何中间产物[57]。然而，来自双子叶植物刺甘草(Glycyrrhizaechinata)和蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)的CYP93B家族的成员，以及来自单子叶植物高粱(Sorghumbicolor)和水稻的CYP93G家族的成员在重组酶分析中显示出黄烷酮2-羟化酶活性，并且只能在酸处理后的反应产物中检测到黄酮。这些酶参与2-羟基柚皮素或黄酮碳苷的生物合成，实际上属于黄烷酮2-羟化酶(Flavanone 2-hydroxylase)[58-61]。此外，来自苔藓植物钝鳞紫背苔(Plagiochasmaappendiculatum)的FNS Ⅰ也被发现能够将柚皮素转化为芹菜素和2-羟基柚皮素，同源性建模和定点突变结果表明其Tyr-240残基是合成2-羟基黄烷酮的关键[62]。

图2 柚皮素在酿酒酵母中的合成途径Fig. 2 Synthesis pathway of naringenin in S. cerevisiae注：Aro3/Aro4为3-脱氧-D-阿拉伯糖型-庚酮糖酸-7-磷酸合成酶。

关于FNS在植物体内的作用机理及调控其表达水平的研究不及PAL和CHS丰富。Tan等人在转基因芹菜(ApiumgraveolensL.)中过表达FNS可显著增加芹菜叶柄中芹菜素的含量[63]。芹菜素是FNS的催化产物，也是合成粗毛豚草素的重要前体化合物。芹菜素在植物中分布广泛，对正常细胞的内在毒性较低，并能诱导植物的抗氧化防御系统。最近的一项研究表明，来自黄丝瓜藓(Pohlianutans)的FNS Ⅰ主要分布在细胞质中，在拟南芥中过表达PnFNS Ⅰ可促进芹菜素的合成，提高活性氧清除酶的活性，同时减轻柚皮素引起的生长抑制，增强了转基因植株对干旱胁迫和紫外线辐射的抵抗力[64]。Lam等人通过敲除水稻中的FNS Ⅱ发现突变体中类黄酮合成基因的表达水平没有显著变化，但是细胞壁中芹菜素等黄酮类化合物大量减少[65]。Jiang等人在大豆中利用RNA干扰沉默FNS Ⅱ基因抑制了芹菜素的合成，同时显著提高了异黄酮染料木素的含量[66]。这是由于在植物体中黄酮和异黄酮合成途径竞争同一底物柚皮素，因此在植物体中抑制异黄酮合成酶(Isoflavone synthase, IFS)、FLS、F3H等与FNS存在竞争关系的酶，也是提高粗毛豚草素产量的有效手段之一。此外，近年关于利用工程菌合成芹菜素的研究主要集中于大肠杆菌(Escherichiacoli)、白色链霉菌(Streptomycesalbus)等原核生物。由于FNS Ⅱ为细胞色素P450依赖型单加氧酶，不仅需要与细胞内质网膜结合，还需要NADPH-细胞色素P450还原酶(NADPH-cytochrome P450 reductase, CPR)提供电子，而原核生物中没有内质网膜，因此来自欧芹的不需要与膜结合的PcFNS Ⅰ在构建生产芹菜素的工程菌中备受青睐[67]。而大肠杆菌等革兰氏阴性菌的外膜含有内毒素，对人体不利且不易去除，所以白色链霉菌等革兰氏阳性菌成为了工业上生产粗毛豚草素理想的生物反应器[68]。Laura等人已利用PcFNS Ⅰ等来自不同物种的基因在白色链霉菌中成功构建了芹菜素的合成途径[69]。

2.4 其他基因

C4H属于P450 CYP73家族，是粗毛豚草素合成途径的第一个羟化酶，也是植物中第一个被鉴定的CYP450单加氧酶，目前已从拟南芥、大豆、地黄等多种植物中分离[70]。C4H定位于内质网，共包含两个核心结构域：一是N端螺旋状的富含脯氨酸的疏水结构域，是蛋白质进入内质网膜的锚点，二是C端半胱氨酸亚铁血红素结合域[71]。最近，Bixia等人分析了高粱C4H蛋白(CYP73A33)的晶体结构，发现C4H的结构和功能特征与其他P450蛋白高度相似，利用Phe-107、Val-118、Phe-119、Val-301、Ala-302、ILe-367、Val-371和Phe-484的疏水侧链与肉桂酸的苯丙烯部分结合[72]。研究表明C4H的过表达可以增加黄酮等酚类化合物的积累，从而增强植株对干旱、盐、H2O2等胁迫的抗性[73-75]。4CL也是调节类黄酮等次生代谢产物生物合成的关键酶，在植物体中通常由多个基因编码，同工酶大多分为两类，Ⅰ型4CL与木质素的生物合成有关，Ⅱ型4CL主要负责类黄酮的合成[76]。来自毛白杨(Populustomentosa)的4CL蛋白晶体研究表明，具有催化活性的氨基酸残基Lys-438、GIn-443和Lys-523为4CL的活性位点，Tyr-236、Gly-306、Gly-331、Pro-337和Val-338负责底物识别。4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸都可以被4CL催化，而4CL的底物特异性由底物识别口袋的大小决定[77]。此外，4CL基因家族还包括腺苷酸形成酶——4CL-like基因，与具有两个保守肽基序(AMP结合域，Box Ⅰ，SSGTTGMPKGV和催化活性中心，Box Ⅱ，GEICIRG)的真实4CL基因高度相似，只是4CL-like酶对4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸等底物没有活性，且大多数4CL-like酶的功能未知[78]。4CL在植物体中的调控可能与组织特异性表达、不同发育阶段以及环境胁迫有关，其调控机理已在拟南芥、毛白杨、烟草、丹参等植物中得到研究[79-82]。

CHI是粗毛豚草素合成途径中的另一限速酶，属于类黄酮生物合成途径，能够使柚皮素查尔酮快速异构形成柚皮素。虽然CHI不是柚皮素查尔酮异构化的必要条件，但在有CHI的情况下柚皮素查尔酮异构化的速率是其自发异构化速率的3600万倍[83-84]。目前发现的CHI家族基因分为四种类型，Ⅰ型CHI只对柚皮素查尔酮有活性；Ⅱ型CHI不仅作用于柚皮素查尔酮，还能催化异甘草素(6′-脱氧查尔酮)形成甘草素(5′-脱氧黄烷酮)，该酶被认为主要存在于豆科植物，近年发现在苔类、蕨类等植物中也有分布；Ⅲ型和Ⅳ型CHI不具有催化活性，前者在拟南芥中表现出脂肪酸结合蛋白(Fatty acid bindingprotein, FAP)的活性，影响脂肪酸在其胚胎发育过程中的合成及积累；后者可能影响类黄酮及花色素的合成[85-86]。紫苜蓿中CHI的晶体结构表明，两个水分子和Lys-97、Ala-49、Tyr-15、Tyr-106、Thr-48残基构成了催化中心[87]。最近的一项研究发现CHI是从没有催化活性的蛋白演变而来，在进化过程中，催化中心的细微变化使以前不活跃的口袋产生活性，这与酶总是通过失去催化残基演变成支架蛋白或调节蛋白的进化趋势相反[88]。

F6H和F6OMT分别负责粗毛豚草素C-6位的羟基化和氧甲基化，是形成粗毛豚草素必不可少的结构基因。目前关于F6H的研究较少，可能来自两类CYP450家族，一类是首次从大豆中发现的CYP71D9家族的类黄酮 6-羟化酶，黄烷酮、二氢黄酮醇等C-2,3位饱和的类黄酮化合物是其最优底物，对黄酮、异黄酮的催化效率较低[89]；另一类是来自CYP82D家族的CYP82D33(罗勒，OcimumbasilicumL.)和CYP82D62(辣薄荷，MenthaxpiperitaL.)，只对C-5位羟基化和C-7位氧甲基化的底物有活性，对芹菜素的活性较低[90]。而近年发现的来自黄芩中的F6H(CYP82D1.1)对黄芩素、芹菜素等黄酮具有广泛的特异性，因此也被用于代谢工程制备黄芩素及野黄芩素[91-92]。此外，Anzellotti等人从金腰属植物(Chrysospleniumamericanum)中分离出了一种特别的F6H，只对黄酮醇3,7,4′-三甲基槲皮素有活性，与FNS Ⅰ等同属于2-ODD家族[93]。植物中的OMTs主要依赖S-腺苷-1-甲硫氨酸(SAM)提供甲基，根据其氨基酸大小分为两类，Ⅰ型OMT以咖啡酰辅酶A氧甲基转移酶(Caffeoyl-CoAO-methyltransferase, CCoAOMT)为主，约23-29 kDa，主要作用于邻苯二酚类化合物的间位羟基，且与底物结合的过程需要Mg2+、Ca2+等二价阳离子参与；Ⅱ型OMT以咖啡酸氧甲基转移酶(Caffeic acidO-methyltransferase, COMT)为主，约38～43 kDa，主要作用于黄酮、木质素等化合物的对位羟基，且催化过程不需要金属阳离子的参与，类黄酮O-甲基转移酶多属于Ⅱ型OMT[94-97]。黄酮O-甲基转移酶主要作用于A环的C-7位和B环的C-3′,4′,5′位，目前已鉴定出的F6OMT较少[98]。来自冰叶日中花(MesembryanthemumcrystallinumL.)的Ⅰ型OMT对含邻二羟基结构的化合物有广泛活性，但不能特异性催化C-6位羟基[99]。此外，来自罗勒的FOMT3-6对野黄芩素的C-6位羟基也有催化作用，但对C-7位羟基具有更高的活性，且以7-甲基野黄芩素为底物时，其F6OMT活性被F4′OMT活性取代[100]。而柑橘(Citrusdepressa)中的Ⅱ型OMT不仅具有底物特异性，还具有区域选择性，能够催化单羟基黄酮，对C-3,5,6,7位羟基都有作用[101]。近年从苔藓植物钝鳞紫背苔中(P.appendiculatum)分离出了第一个对黄酮C-6位羟基基团表现出底物偏好性的Ⅰ型OMT，能够将黄芩素和野黄芩素分别转化为千层纸素A和粗毛豚草素，可用于生产粗毛豚草素或提高其含量[102]。

3 结 语

粗毛豚草素因其良好的抗癌活性受到了国内外学者的广泛关注。目前对其生物合成途径中相关基因的研究十分丰富，但是参与合成的基因多来自不同植物，还没有发现粗毛豚草素在单一植物中生物合成的相关报道，很多FNS、F6H、F6OMT的结构也有待进一步研究。借助分子生物学手段研究药用植物活性成分的生物合成及其调控机制，并利用代谢工程技术生产或提高活性成分的产量是现代药用植物研究的热点和趋势。未来，基因工程和代谢工程的发展以及黄酮类化合物生物合成相关基因的研究将为粗毛豚草素的临床研究与应用提供坚实的物质基础。