一株猪源植物乳杆菌对大肠杆菌ATCC25922的抑制作用研究

曹海鹏，文小飞，徐兴娜，辛健康

（贵州师范大学 生命科学学院，贵州 贵阳 550001）

养殖业中，大肠杆菌常引起仔猪发生肠道传染性疾病，如仔猪黄痢、白痢和水肿病等，是造成猪腹泻、死亡的重要细菌性因素[1]。目前，治疗和预防猪细菌性疾病的常规措施依然是投喂抗生素，其作为饲料添加剂曾为规模化养殖业的快速发展作出了巨大贡献。但由于抗生素的长期不合理使用，导致了一系列问题，如肉制品抗生素残留超标，严重危害人类及其他动物健康；致肠道菌群失调及产生细菌耐药性等，使动物机体免疫力下降，易引发内源性感染和一系列的公共安全问题[2]。因此，欧盟已于2006年全面禁止在饲料中添加抗生素，随后日本和美国也在饲用抗生素种类及使用方面做了严格限制[3]。

乳酸菌是食品级益生菌，具有抑制病原菌生长、调节肠道菌群平衡、激活肠道黏膜免疫及佐剂效应等多种生理功能，在预防及治疗细菌性疾病方面具有一定优势，是养殖业中抗生素的理想替代品[4,5]。研究表明，乳酸菌可以有效增加母猪采食量，降低哺乳期母猪失重幅度及仔猪因感染细菌性疾病导致的腹泻率与死亡率[6,7]；可以改善动物健康水平，提高仔猪机体免疫力和饲料转化率，促进仔猪生长，预防仔猪腹泻[8]；可以在仔猪肠道定植，促进仔猪生长发育，抵抗产肠毒素大肠杆菌的感染，降低仔猪的发病率和死亡率[9]。由于乳酸菌及其产生的抑菌物质的特殊性，不会造成大肠杆菌等致病菌对其产生耐药性或抵抗力，在预防和治疗多重耐药病原菌感染方面具有重要的应用价值[10,11]。

实验室前期从健康猪的肠道黏膜中分离出一株对大肠杆菌具有强抑制作用的植物乳杆菌R-21，具有一定的研究和应用价值[12]。为促进其在生产中的应用，本研究拟从菌株发酵液对大肠杆菌的抑制特性、乳酸菌与大肠杆菌的体外共培养及乳酸菌的抑菌稳定性等方面，继续研究植物乳杆菌R-21对大肠杆菌的抑菌特性。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种 植物乳杆菌R-21，本实验室自行分离并保藏[12]；大肠埃希氏菌ATCC25922，购于上海鲁微科技有限公司。

1.1.2 培养基 MRS培养基：蛋白胨10.0 g，酵母膏10 g，牛肉膏10 g，吐温80 1.0 ml，葡萄糖20.0 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，七水硫酸镁0.58 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水 1 000 ml，pH 6.2～6.6，121℃高压灭菌20 min。固体MRS在此基础上添加1.5%琼脂粉[9]。

LB培养基：蛋白胨10.0 g，酵母粉5.0 g，氯化钠10.0 g，水1 000 ml，121℃高压灭菌20 min。固体LB在此基础上添加1.5%琼脂粉[9]。

伊红美兰琼脂培养基（EMB），购于广东环凯微生物科技有限公司。

1.1.3 试剂 主要化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

JA1003 电子天平：力辰科技有限公司；DH6000B电热恒温培养箱：天津市泰斯特仪器有限公司；XMTA-7000智能恒温干燥箱：上海景迈仪器设备有限公司；THZ-82A双数显旋转气浴振荡器：金坛市城东新瑞仪器厂；SW-CJ-1G单人净化工作台：上海苏净净化工作台；FE20 pH计：深圳市科力易翔仪器设备有限公司；HVE-50高压蒸汽灭菌锅：日本HIRAYAMA公司。

1.3 方法

1.3.1 菌种活化 取冰箱冷藏的植物乳杆菌R-21和大肠埃希氏菌ATCC25922斜面种子，分别以平板划线方式接种于固体MRS和LB培养基中，37℃活化培养36 h，取单菌落转接于相应斜面培养基中，培养并保存备用。

1.3.2 不同培养时间的抑菌活性 取1.3.1活化的植物乳杆菌R-21和大肠埃希氏菌ATCC25922斜面种子，分别转接于10 ml MRS和10 ml LB液体培养基中，37℃、150 rpm振荡培养24 h。各取1%种子液接种于200 ml相应的液体培养基中振荡培养，其中ATCC25922培养约12 h，置于4℃冰箱保存备用；植物乳杆菌R-21培养48 h，其间每隔4 h取样5 ml，离心取上清液，检测其pH，并各取200 μl进行抑菌试验。抑菌试验为牛津杯法，具体如下：取稀释100倍大肠杆菌ATCC25922菌液，均匀涂布于LB平板中，每皿等距离放入两只6 mm内径的牛津杯，杯中加入200 μl的乳酸菌上清液，置于37℃恒温培养箱过夜培养，并采用游标卡尺测量各时间点发酵上清液的抑菌圈直径，每样3个平行[13]。

1.3.3 发酵上清液对大肠杆菌的抑制效果 取培养48 h的乳酸菌发酵上清液，微孔滤膜过滤后加在等体积、离心处理的大肠杆菌沉淀样品中，置于室温，悬浮后取处理0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h的指示菌菌液各1 ml，梯度稀释后取200 µl稀释液涂布于LB平板中，37℃静置培养24 h，统计残留活菌数（colony-forming units,CFU），计算各处理时间点的存活率。

1.3.4 植物乳杆菌R-21与大肠杆菌的体外共培养试验 将制备的植物乳杆菌R-21与大肠杆菌ATCC25922菌液分别用无菌水稀释至约1.0×108CFU/ml，各取2%体积接种于MRS液体培养基中，37℃、150 rpm震荡培养。取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h的菌液各5 ml，检测pH后再梯度稀释取200 µl稀释液均匀涂布于EMB平板中，37℃静置培养24 h，统计残留大肠杆菌活菌数，计算各处理时间点的存活率。

1.3.5 植物乳杆菌R-21的抑菌稳定性试验 取植物乳杆菌R-21的种子液，以1%比例接种于MRS液体培养基中，37℃、150 rpm培养24 h；再取1%比例接种于MRS液体培养基中，重复培养10次，每次取5 ml菌液离心，取上清液并保存-20℃备用。连续培养结束后，取收获的上清液进行抑菌试验，每组3个平行，统计抑菌直径，并评价其抑菌稳定性。

2 结果与分析

2.1 不同培养时间的抑菌活性

植物乳杆菌R-21培养48 h，其发酵过程发酵上清液中的pH及对大肠埃希氏菌ATCC25922的抑菌直径变化如图1所示。pH随培养时间逐渐下降，由0 h的5.4降至40 h的3.0，并保持稳定；抑菌直径从0 h的6.7 mm增至24 h的22 mm左右，并保持基本稳定。与缪璐欢等（2015）[14]、杜静芳等（2017）[15]所分离的乳酸菌相比，总体变化规律一致，但产酸较缓慢，最终pH较低，说明其产酸持续时间长且数量多；抑菌活性同样是缓而强劲，最终抑菌直径大于乳酸菌LY-19和LY-21对大肠杆菌O157:H7的抑菌直径。从图中还可得知，抑菌直径的增加与pH下降呈正相关，说明发酵上清液中主要抑菌物质可能为有机酸。0 h时的pH与培养基的初始pH不一致，且抑菌直径不是牛津杯直径（6 mm），这是种子液加入造成的，因为种子呈酸性，且含有少量的抑菌物质。

图1 发酵液pH及抑菌直径随培养时间的变化

2.2 发酵上清液对大肠杆菌的抑制效果

取乳酸菌发酵上清液室温处理0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、7 h、8 h、9 h、10 h的指示菌菌液，梯度稀释后取200 µl稀释液涂布于LB平板中，培养后统计残留活菌数对数值，结果如图2所示。上清液处理2 h，大肠埃希氏菌ATCC25922的残留对数值下降0.93 log，3 h时迅速降至5.26，至6 h时上清液中检测不到活菌，抑菌效果大大优于Koo等（2015）所分离菌株对大肠杆菌的抑制和杀灭效果[16]。表明乳酸菌R-21发酵上清液对大肠埃希氏菌ATCC25922具有极强的抑菌能力，能够在短时间内杀死被处理的指示菌，在预防和治疗大肠杆菌性疾病方面具有一定的研究和应用价值。

图2 经乳酸菌发酵上清液处理的大肠杆菌残留对数值

2.3 植物乳杆菌R-21与大肠杆菌的体外共培养试验结果

将植物乳杆菌R-21与大肠杆菌ATCC25922菌液分别稀释至1.0×108CFU/ml，各取2%体积接种于MRS液体培养基中震荡培养。取0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h、14 h、16 h的菌液，检测pH，梯度稀释取200 μl均匀涂布于EMB平板中，静置培养24 h，并统计残留大肠杆菌活菌数（CFU/ml），结果如图3所示。共培养菌液pH随培养时间逐渐下降，至16 h下降至3.4左右，接近植物乳杆菌R-21单独培养时的菌液pH，说明其R-21菌株产酸能力强，产酸虽缓慢，但总体基本不受共培养时大肠杆菌生长的影响；大肠杆菌残留活菌数log值开始时随培养时间逐渐增加，4～6 h达到平衡，而后开始迅速下降，至16 h时EMB培养基中检测不到存活大肠杆菌。这一研究结果与Koo等（2015）研究结果差异极大，其所分离的菌株主要抑菌物质是有机酸，且抑菌直径较小，对指示菌只起到抑制作用而非杀菌[16]。本研究中，残留指示菌的数量迅速减少，说明R-21菌株所产抑菌物质能直接杀死被处理的指示菌。

图3 植物乳杆菌R-21与指示菌的体外共培养试验结果

2.4 植物乳杆菌R-21的抑菌稳定性试验结果

取植物乳杆菌R-21的种子液，以1%比例接种于MRS液体培养基中，37℃、150 rpm培养条件下，连续传代培养10次，取每次培养的上清液进行抑菌试验，验证传代多次之后的抑菌稳定性，结果如图4所示。连续传代培养10次中，每次培养24 h，只有第5次乳酸菌上清液的抑菌直径小于20 mm（约19.6 mm），其余9次抑菌直径为20～24 mm，且没有明显的下降趋势，说明R-21菌株具有相对的抑菌稳定性，有利于菌种的长期保存和工业生产。

图4 植物乳杆菌R-21的传代抑菌稳定性试验结果

3 结论

通过研究分离菌株植物乳杆菌R-21对指示菌ATCC25922的抑菌特性，发现菌株R-21发酵上清液对指示菌有较强的抑制作用，且抑制作用与发酵过程中产生的酸性物质有关；乳酸菌上清液及与指示菌共培养时，对指示菌具有杀灭作用，抑菌活性强；菌株R-21产酸能力较强，培养48 h发酵液pH低至3.0左右；连续传代培养中，上清液对指示菌的抑菌直径基本维持在20～24 mm，具有一定的遗传稳定性，说明R-21菌株适合于工业生产及保存。