内生真菌发酵对刺五加异嗪皮啶合成的影响

万 璐，闫佳佳，郑春英

（1黑龙江大学/农业微生物技术教育部工程研究中心，哈尔滨 150500；2黑龙江大学生命科学学院/黑龙江省普通高校微生物重点实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

刺五加(Acanthopanaxsenticosus)为五加科植物刺五加的干燥根和根茎或茎[1]，主要分布于中国东北部，为药食同源功能性保健食品[2]。现代研究表明，刺五加具有抗肿瘤[3]、抗疲劳[4]、抗炎[5]、降压[6]、抗心肌缺血[7]、免疫调节[8]等作用，其主要的活性成分为刺五加苷[9]、黄酮类成分[10]、多糖[11]、香豆素[12]等，其中刺五加香豆素成分的代表为异嗪皮啶，该成分是刺五加的重要指标性成分[13]，其结构见图1。

图1 异嗪皮啶化学结构

异嗪皮啶具有抗炎[14]、抗氧化[15]、抗肿瘤[16]、冠脉保护[17]及神经保护[18]等生物活性，并具有无毒、口服易吸收的特点[19]，其具有多靶点作用已成为研究热点。异嗪皮啶通常由天然植物中分离得到，尤其是从刺五加植物中分离得到[20]，并作为主要的活性成分指标来评价其质量及代谢机制。随着异嗪皮啶应用的广泛，有学者采用化学合成的方法制备异嗪皮啶[21]，但化学合成方法往往步骤较多，中间产物控制条件较严格，因而增加了合成的成本和难度。

发酵技术利用微生物的强大酶系，定向生物转化天然食品中的某些活性成分，并通过这样的生物转化保护某些活性成分，提高活性成分的得率[22]，是功能性保健食品活性成分获得的新方法。本研究在前期工作的基础上[23]，利用植物内生菌参与宿主植物活性成分生物转化的机制，使其诱导宿主植物活性代谢产物产生[24]，选取刺五加内生真菌发酵刺五加，以定向高效产生刺五加中异嗪皮啶成分；同时采用柱色谱法对发酵刺五加中异嗪皮啶成分进行分离，确定工艺路线，旨在提高异嗪皮啶的得率并最大限度提高刺五加资源利用率，为定向生产异嗪皮啶提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

3年生野生健康刺五加样品，采自黑龙江省帽儿山地区，存于黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室。刺五加内生真菌AJ7、AJ14、AJ15、AJ19由黑龙江大学生命科学学院生物制药专业实验室分离得到。

PDA培养基（配方及配制方法参阅文献[25]）。供含量测定用异嗪皮啶（中国药品生物制品检定院）。

1.2 主要仪器

FL2200型高效液相色谱仪（浙江温岭福立分析仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 发酵样品的制备 分别取已活化的4株刺五加内生真菌，参阅文献[26]制备菌悬液(1×107CFU/mL)；精确称取刺五加根、茎粉末（阴干，粉碎，40目筛）各6 g，分别置于三角瓶中，加水（料液比1:5）密封，作为底物，灭菌（121℃，灭菌30 min）；分别取上述4种菌悬液各5 mL加入底物中(n=10)，摇床发酵培养（28℃，140 r/min，15天），取出冻干，作为发酵样品，备用；另取无菌水5 mL加入底物中，同法培养作为空白对照样品。

1.3.2 发酵前后刺五加异嗪皮啶成分的动态变化 参阅文献[27]确定HPLC分析条件为：Venusil XBP-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，USA)，流动相为乙腈:0.1%磷酸(20:80)，流速1 mL/min，检测波长343 nm，进样量10 μL。

（1）对照品溶液的制备。精密称取异嗪皮啶对照品，加入适量甲醇溶剂，制成1.0 mg/mL对照品溶液，备用。

（2）供试品溶液的制备。精密称取1.3.1发酵样品1.0 g，加入10 mL甲醇溶剂，超声1 h，取出，放冷，甲醇补足减失的溶剂，过滤（0.45 μm微孔滤膜），即为供试品溶液，备用。

（3）HPLC测定。分别精密吸取上述对照品溶液及供试品液，进样，测定(n=3)，计算含量，观察异嗪皮啶含量的动态变化，并根据HPLC测定结果确定发酵菌株。

1.3.3 发酵刺五加中异嗪皮啶的分离 根据1.3.2分析结果确定发酵菌株，按1.3.1方法制备刺五加发酵样品，取发酵样品200 g，加入95%乙醇1600 mL，热回流提取180 min，过滤，滤液浓缩至100 mL，以氯仿萃取3次，每次100 mL，合并萃取液，回收溶剂并浓缩至清膏（相对密度约1.10），采用硅胶拌样均匀后，将其通过硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯(1:1)洗脱，分离工艺流程见图2。

图2 发酵刺五加中异嗪皮啶成分的分离工艺流程

1.3.4 发酵菌株的鉴定 参阅文献[28]，采用形态学观察及ITS rDNA序列扩增及序列分析法对发酵目的菌株进行种属鉴定（通用引物IS1、IS4及PCR产物测序均委托上海生工生物工程股份有限公司）。将所得序列提交GenBank数据库，采用Blast分析与GenBank中序列进行比较，构建系统发育树（MEGA 6.0软件），确定亲缘关系和系统进化分析。

2 结果与分析

2.1 发酵前后刺五加中异嗪皮啶成分的动态变化结果

由图3可以看出，刺五加样品在与刺五加生药及异嗪皮啶对照品相同的保留时间内有相同的色谱峰，该色谱峰明显增高。

图3 内生真菌AJ14发酵刺五加后的HPLC色谱图

由表1、图4可以看出，4株刺五加内生真菌(AJ7、AJ14、AJ15、AJ19)均能使发酵刺五加样品中异嗪皮啶活性成分含量提高，但提高程度有差别，其中以内生真菌AJ14提高发酵样品中异嗪皮啶含量作用最为显著。与刺五加生药相比，AJ14发酵刺五加茎和根样品中异嗪皮啶成分的含量得到显著增长，其增长率分别为刺五加茎及根的2.62、1.52倍，而且均高于其他3株内生菌发酵样品中异嗪皮啶成分的增长幅度(P＜0.01)。因此选取菌株AJ14作为发酵目的菌株，以最大化提高发酵样品中异嗪皮啶成分含量。

表1 刺五加发酵样品中异嗪皮啶含量测定结果 mg/g

图4 刺五加茎发酵样品异嗪皮啶含量测定结果

2.2 发酵刺五加中异嗪皮啶成分的分离结果

采用对照品跟踪法对AJ14发酵刺五加样品中异嗪皮啶成分进行分离，其中在洗脱剂为石油醚:乙酸乙酯(1:1)的馏分中得到单一斑点，且与异嗪皮啶对照品Rf值相近，结果见图5。回收该馏分溶剂，经乙醇重结晶，得淡黄色结晶（115.45 mg，得率为0.58 mg/g）；同法从生药刺五加中提取分离异嗪皮啶，结果得到淡黄色结晶（13.87 mg，得率为0.07 mg/g）。分别采用3种色谱条件（①乙腈:0.1%磷酸(1:4)；②乙腈:甲醇:水:冰醋酸(17:3:80:1)；③甲醇:0.05%三氟乙酸(25:75)）对所得结晶采用HPLC进行纯度分析，结果表明，该结晶纯度较好，其中色谱①的分析结果见图6。

图5 TLC检测结果

图6 分离得到的异嗪皮啶结晶HPLC色谱图

由图6可知，从刺五加发酵样品中分离得到的结晶纯度较高，经计算其纯度为99.10%，并且该结晶与对照品异嗪皮啶具有相同的保留时间，最后采用对照品加入法确定该成分为异嗪皮啶。

上述结果说明，使用刺五加内生真菌发酵刺五加可以明显提高异嗪皮啶含量，使刺五加原料得到最大限度的利用；同时，采用一次硅胶柱色谱分离法可以分离发酵刺五加样品中异嗪皮啶成分，工艺流程操作简单、易行，适合异嗪皮啶成分原料的生产。

2.3 刺五加内生真菌AJ14鉴定结果

刺五加内生真菌AJ14经28℃、7天PDA培养后，菌落生长较快，菌丝体显白色，分生孢子面为赭黄色，质地丝绒状，分生孢子头球形，顶囊球形，直径35 μm，表面全部可育，产孢结构双层（图7）。参阅《真菌鉴定手册》[29]，初步认定内生真菌AJ14菌株为赭曲霉属菌。

图7 AJ14菌落形态及孢子显微结构

内生真菌AJ14经PCR扩增获得1条567 bp的特异性条带，将该测序结果在GenBank中进行BLAST同源性比对，构建系统发育树（MEGA6.0软件），结果见图8。内生真菌AJ14菌株（菌种登录号MT826636）的ITS rDNA序列与赭曲霉属菌(AspergillusochraceusKJ783266.1)的同源性达到了98%以上，结合形态学观察结果，将内生真菌AJ14菌株鉴定为赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。

图8 内生真菌AJ14菌株的系统发育树

3 结论与讨论

尽管发酵技术用于食品的生产有着悠久的历史[30]，但采用发酵技术定向提高天然食品中的活性成分的研究鲜有报道。本研究是在课题组前期研究基础上[31]，基于异嗪皮啶的生物合成，结合内生真菌能够参与宿主植物活性代谢物生物合成的研究基础，采用4株刺五加内生真菌发酵宿主植物刺五加，旨在高效生产异嗪皮啶，并对其采用柱色谱法进行分离，以最大限度利用刺五加资源；同时，为深入研究内生真菌发酵刺五加的机理，也对所筛选目的菌株AJ14进行菌种鉴定。研究结果表明，采用刺五加内生真菌AJ14发酵刺五加后，其异嗪皮啶成分含量得到显著提高；同时，针对异嗪皮啶成分，采用一次柱色谱分离法从发酵刺五加样品中分离得到异嗪皮啶；目的菌株AJ14经鉴定为为赭曲霉菌(Aspergillusochraceus)。

本研究表明，内生真菌发酵法可定向促进刺五加中异嗪皮啶的生物合成；同时，采用一次柱色谱法分离发酵样品中异嗪皮啶的工艺简单易行，适合异嗪皮啶原料的工业化生产。同时，在研究过程中发现，内生真菌发酵刺五加时也有其他未知化合物的生成，为了阐明内生真菌发酵刺五加的机理，后续课题组将对发酵刺五加中的代谢产物进行系统分离，以发现新型活性代谢产物，为创制新药、研发新型功能性保健食品奠定基础。