氧化应激在心肌缺血再灌注损伤中的研究进展

毛子奇，袁伟

(江苏大学附属医院心血管内科，江苏 镇江 212001)

近年来，虽然循证医学的发展和生活方式的改变极大降低了冠心病的死亡率，但心肌梗死仍是全球疾病死亡的主要原因之一，每年约有600多万人死于心肌梗死[1]，对国民经济造成巨大负担。有研究表明，急性心肌梗死的发生率和死亡率与收入成反比，这可能由于高收入国家更多地使用了预防措施和进行血运重建[2]。随着再灌注策略在临床的广泛运用，急性心肌梗死治疗的重点已从降低死亡率转移至改善患者的生存预后，避免梗死后心力衰竭的发生。然而，早期的血运重建虽然可以最大限度地挽救缺血心肌，但也会不可避免带来另一种额外损伤，即再灌注损伤。因为再灌注会引发一系列事件，如氧化应激、线粒体功能障碍、炎症等[3-4]，可能会使缺血心肌遭受二次打击，导致心脏结构和功能的损伤，带来很多的梗死后遗症。这些证据表明，可以通过分子和细胞信号转导机制去了解疾病并从中找到治疗方法。有文献报道，早期再灌注会产生活性氧类(reactive oxygen species，ROS)，而过量的ROS能够导致钙超载、凋亡、细胞因子上调以及DNA和蛋白质的改变[5]，进而加重心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia-reperfusion injury,MIRI)。因此，有效清除过量的氧自由基或ROS可能能为减轻MIRI提供理论基础和治疗靶点。现就氧化应激在MIRI中的研究进展予以综述，旨在为临床应用抗氧化治疗预防再灌注损伤提供参考。

1 氧化应激与ROS

2 心肌细胞ROS的主要来源

2.2溶酶体生成的OH·溶酶体负责受损或过剩结构的调控，维持自噬降解。因其对多种含铁大分子物质的降解，使区室内富含疏松的氧化还原活性铁，可以与线粒体中逸出的少量H2O2发生芬顿反应，生成OH·[15]。而包括心肌缺血再灌注在内的大多数病理过程均可能会使氧化应激在线粒体被启动，继而生成大量的H2O2，放大这种线粒体与溶酶体之间的串扰现象，导致溶酶体内OH·不断累积，促使溶酶体膜过氧化和透化，造成其稳定性丧失，释放出大量组织蛋白酶，诱导细胞凋亡或坏死[15-16]。因此，通过靶向调控溶酶体内氧化还原活性铁的含量来抑制过量ROS生成也是一种减少氧化应激损伤的潜在治疗方法。

2.3内质网生成的ROS 内质网是高效合成和折叠蛋白质的重要场所，在氧化性蛋白质折叠过程中，二硫键的形成是一个主要过程。而蛋白质二硫键异构酶催化反应中每形成一个二硫键，均会产生一个氧化当量H2O2，这是内质氧化还原素1催化蛋白质二硫键异构酶再氧化的结果。而H2O2作为蛋白质折叠的副产物可以被谷胱甘肽过氧化物酶利用，减轻内质网氧化负荷[17]。但是缺血再灌注会增加未折叠蛋白应答的激活和错误折叠蛋白的积累，导致内质网应激这一病理改变。在此背景下，内质网氧化还原平衡失调，过量的H2O2无法被清除和利用[17-18]。同时，还有研究表明未折叠蛋白应答的激活可以通过影响线粒体功能导致ROS水平进一步升高[17]，这也从侧面证明了上述mtROS的产生存在多种不同的病理机制。

3 氧化应激导致MIRI的机制

冠状动脉闭塞引起的心肌缺血是心血管相关死亡的主要原因，而最常见的治疗策略为早期恢复缺血区灌注[2]。但是再灌注时心肌会产生大量ROS，引起细胞死亡和功能障碍，导致原缺血组织的进一步损伤。同时，氧化应激导致MIRI的机制十分复杂，目前仍不清楚，现从以下几方面进行探讨。

3.2过度自噬 基础水平的自噬通常被认为是对压力的保护性反应，它通过清除受损的蛋白质和老化的细胞器来维持细胞内稳态，但在心肌缺血再灌注期间，自噬并不总是具有保护作用，过度自噬会导致自噬体的大量积累和关键蛋白质及细胞器的异常降解[24]。以往研究表明，再灌注过程中的氧化爆发能够促进p53/心肌素的信号转导，诱导微管相关蛋白1轻链3脂化，上调自噬通量和自噬关键蛋白Beclin1表达，极大地提高自噬活性，导致心肌细胞死亡并加速缺血性损伤[24]。Dang等[25]的报道与这个观点一致，缺血再灌注期间自噬通量受损以及自噬溶酶体功能障碍，这种无效自噬表现为自噬体的积累。自噬相关基因7是自噬体产生的关键因素，其充当泛素活化酶E1，在自噬体膜的起始和扩增中至关重要。在一项体内外实验中，高级糖基化终末产物的可溶性受体被证实可以与细胞膜上的整合素相互作用，增强泛素蛋白酶体系统和信号转导及转录激活因子3的活化，而信号转导及转录激活因子3的活化可以抑制缺血再灌注期间细胞质中的氧化应激，从而减少自噬相关基因7的表达，抑制过度自噬的发生，改善心脏功能并减小梗死面积[25]。此外，有研究称由于长期处于高糖环境，心肌缺血再灌注时的氧化应激水平显著升高，而抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸可以通过抑制ROS，从而抑制过度自噬的形成，在糖尿病性心脏病的缺血再灌注中起保护作用[26]。相反，溶酶体膜上的通道蛋白粘脂蛋白1既是钙的主要释放者，同时也是氧化还原的传感器，过量mtROS可以直接激活粘脂蛋白1，诱导钙释放，触发钙调磷酸酶依赖的转录因子EB核转位，上调线粒体自噬，促进功能失调的线粒体和ROS的清除，降解受损泛素化蛋白，对氧化应激提供细胞保护，而线粒体自噬被抑制和自噬缺失在心肌凋亡过程中也被证明起到部分促进作用[27-28]。可见，自噬是对细胞压力的应答，而维持其正常运转在缺血再灌注中起重要作用。

3.3炎症小体活化 炎症小体是一种多蛋白复合物，包含胱天蛋白酶1、凋亡相关斑点样蛋白和核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)。作为固有免疫系统不可或缺的组成部分，炎症小体的活化诱导胱天蛋白酶1切割消皮素D蛋白，使细胞不断肿胀直至膜完整性丧失，并促进白细胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-18的成熟和分泌以及细胞内容物的泄漏，导致一种称为焦亡的促炎形式的程序性细胞死亡[29]。近年有两项研究均分别通过体内外实验阐释了NLRP3激活的两种不同机制：前者在转录水平上由核因子κB驱动，在缺血再灌注损伤中，核因子κB被Toll样受体(Toll-like receptor，TLR) 信号通路以髓样分化因子88依赖途径激活，随后刺激IL-1β、IL-18表达[29]。而后者在转录后水平上被诱导，包括NLRP3的激活，由许多激活因子驱动，如缺血再灌注损伤中过量的ROS[4]。因为在MIRI中NLRP3炎症小体的激活至关重要，所以有学者提出通过抑制核因子κB和消皮素D蛋白可以减轻炎症小体诱导的细胞焦亡[30]。同时以往研究显示，不论是线粒体或是Nox来源的ROS，均可以上调硫氧还蛋白相互作用蛋白从而介导NLRP3炎症小体的活化，导致细胞出现炎症和焦亡[4,31]。而通过向动物模型腹腔注射抗氧化药物可以阻断硫氧还蛋白互作蛋白与NLRP3的相互作用，达到抑制NLRP3炎症小体激活和IL-1β成熟的目的[31]。此外，糖尿病作为MIRI的独立危险因素，其心肌缺血再灌注的发生率明显高于非糖尿病患者，基于这些流行病学研究，也有实验表明，再灌注情况下，高糖可以通过增加ROS的产生诱导NLRP3炎症小体介导的心肌细胞焦亡[32]。因此，通过靶向NLRP3炎症小体来限制炎症损伤可能是缺血再灌注的一种新治疗策略。

3.4免疫应答激活 众所周知，缺血再灌注会启动免疫应答，进而激活急性炎症反应，其特征为先天性和适应性免疫系统相关的免疫细胞募集和活化[33]。有证据表明，缺血心肌细胞除了作为靶器官外，还可以促进先天性免疫反应[34]。这种免疫反应的激活主要发生在受损心肌细胞释放损伤相关分子模式与模式识别受体相互作用时，而ROS作为一个重要的损伤相关分子在整个过程中起推动作用[35]。在众多模式识别受体中，TLR引起人们的广泛关注，其中TLR4在心血管疾病中起重要作用。Vilahur和Badimon[35]发现，缺血30 min足以增强循环白细胞的炎性潜能并增加细胞因子的释放，而这种全身性炎症反应与缺血心肌中过量ROS诱导的TLR4-髓样分化因子88信号通路的显著上调有关。此外，巨噬细胞表型极化也是免疫应答激活的重要部分。有研究证实，过量的ROS可以促进巨噬细胞向M1表型极化，这可能由于C型凝集素受体、TLR、NOD样受体等模式识别受体的激活[33]。当巨噬细胞向M1表型极化后，可以直接释放肿瘤坏死因子-α、IL-1β和IL-23，同时上调趋化因子配体1和粒细胞集落刺激因子的分泌，间接介导中性粒细胞的浸润及蛋白水解酶的产生。而中性粒细胞的募集会进一步加剧ROS生成，造成恶性循环，加重心肌损伤[33,36]。Formentini等[36]发现，靶向抑制mtROS可以使巨噬细胞从M1表型向具有抗炎作用的M2表型极化，从而减少细胞损伤。以上数据表明，免疫应答对MIRI存在较大影响。

4 MIRI的抗氧化治疗和临床局限性

近年来，氧化应激导致MIRI备受关注，但抗氧化治疗的临床转化价值仍存在争议。维生素C、维生素E和泛醌10等常见抗氧剂已在动物模型及临床实验中被证明可以通过部分清除ROS或自身氧化而抑制氧化爆发[37-38]。而丙酮酸乙酯这类具有临床安全性的天然抗氧化剂，也被发现可以下调Nox活性从而抑制焦亡[4]。另有研究指出，临床中的一些常用药物，如二甲双胍可以显著上调抗氧化酶的表达以及抑制ROS介导的过度自噬[39-40]，而他汀类药物可以有效降低血浆中过氧化物的水平，对减少氧化产生的DNA损伤有益[41]。但实际上，因为适量ROS具有特定的细胞内功能，而普通抗氧化剂在提供干预治疗的同时会影响未遭受氧化损伤的健康组织，所以基于上述观点，靶向抗氧化剂显示出巨大潜力，如米托蒽醌甲磺酸盐可以与亲脂性三苯基膦结合，在线粒体内生成活性抗氧化泛素，在缺血再灌注模型中阻止mtROS产生[42]，而SS(Szeto-Schiller)肽等[43]靶向肽也可以起到类似作用。同样，选择性靶向溶酶体室的铁螯合剂对减少其内部OH·介导的氧化损伤也有部分作用[44]。

此外，mPTP开放作为缺血再灌注最重要的损伤机制，其非特异性抑制剂环孢素已被报道可以通过抑制亲环素D转位继而阻止mPTP开放，减少心脏手术期间的再灌注损伤[45]。然而，环孢素的免疫抑制特性及其不良反应大大限制了它的广泛应用，有学者认为通过制备新型的线粒体靶向纳米粒子可以减少环孢素对正常组织的免疫作用[46]。同时，也有研究称多肽类药物的预处理和后处理均能触发蛋白激酶的信号瀑布级联反应，从而抑制mPTP开放，具有增加再灌注后心肌耐受性的作用[47]。因此，亲环素D特异性抑制剂的研发、新型生物材料技术的应用以及临床药物的运用需进一步探索。

5 小 结

ROS以低浓度的形式作为生理信号因子贯穿于细胞正常的生长、迁移和死亡过程，但是再灌注在挽救濒死心肌的同时也会促进琥珀酸积累，溶酶体串扰，内质网应激和氧化酶上调这些复杂的病理进程，导致ROS的过量积累，并通过mPTP开放、过度自噬、炎症小体活化以及免疫应答激活等多种方式加剧心肌细胞损伤的发生发展，影响再灌注患者预后，而目前对这些潜在机制的研究仍处于初级阶段，进行深入研究可能能为预防MIRI提供新思路。

此外，外源性抗氧化治疗至今仍存在较大的局限性，虽然某些临床常见的降糖降脂药物也具有一定的抗氧化能力，但仍缺乏大规模研究数据。而一些天然抗氧化剂因成分复杂，临床使用的安全性还有待进一步考证。近年靶向抗氧化剂由于特异性强，不良反应少而备受关注。未来，应充分探究现有药物的循证医学证据及选择靶向干预的新型抗氧化药物以减少MIRI。