DEAH盒解旋酶15对转化生长因子-β1诱导的呼吸道平滑肌细胞增殖和迁移的影响

王 静，康媛洁，王 贞，唐 青，陈 瑶

（1.西安市儿童医院呼吸哮喘中心，陕西 西安 710003；2.西安市儿童医院呼吸二科，陕西 西安 710003）

哮喘是一种慢性、异质性疾病，是儿童最常见的慢性疾病之一，其发病率在世界范围内呈逐年上升趋势［1-3］。哮喘以呼吸道慢性炎症、高反应性、黏液分泌过多和呼吸道壁重塑为特征，其症状包括喘息、咳嗽、胸闷、呼吸道阻塞等［4］。呼吸道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）异常增殖和迁移是呼吸道重塑和慢性呼吸道紊乱的标志之一，在哮喘的发病机制中起着重要作用［5-6］。使用转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）诱导ASMCs是研究哮喘常用的细胞实验方法［12-13］。DEAH盒解旋酶15（DEAH-box helicase 15，DHX15）是DEAH盒解旋酶家族的新成员，其参与前体mRNA的剪接［7-8］。有研究报道，DHX15在多种肿瘤细胞系和正常组织、器官中均有不同程度的表达［9-11］。本研究旨在探讨DHX15对TGF-β1诱导的ASMCs增殖和迁移的影响，以期为哮喘的治疗提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞人ASMCs购自美国Cambrex Bio Science公司，置于液氮罐保存。

1.1.2 试剂与仪器达尔伯克改良伊格尔培养基（Dulbeco′s modified Eagle′s medium，DMEM）和胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自美国Invitrogen公司，RNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司，TRIzol试剂盒、反转录试剂盒、放射免疫沉淀裂解液购自日本TaKaRa公司，二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒和总蛋白提取试剂盒购自北京普利莱基因技术有限公司，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜和Transwell小室试剂盒购自美国Millipore公司，Lipofectamine 3000试剂盒购自美国Gibco公司，细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8，CCK-8）、Tris缓冲生理盐水（Tris-buffered saline and Tween-20，TBST）购自上海碧云天生物技术有限公司，DHX15、磷酸化p65（phosphorylated p65，p-p65）、磷酸化核因子抑制蛋白（phosphorylated nuclear factor inhibitor protein，p-IκB）、磷酸化c-Jun氨基末端激酶（phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK）、磷酸化p38（phosphorylated p38，p-p38）和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自美国CST公司；引物、小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）和DHX15 siRNA的设计、合成由上海生物工程股份有限公司完成；低温高速离心机和多功能酶标仪购自美国Thermo公司，实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time fluorescence polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪购自日本TaKaRa公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及预处理将ASMCs置于含体积分数10%FBS、100 kU·L－1青霉素、100 mg·L－1链霉素的DMEM中，于37℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中传代培养。取对数生长期ASMCs，使用终质量浓度为20 mg·L－1的TGF-β1诱导24 h，待细胞融合达到80%～90%时进行后续实验。

1.2.2 细胞转染及分组取TGF-β1诱导的ASMCs，以每孔1×106个细胞接种于96孔板中，待细胞融合度达到80%～90%时进行转染。根据转染质粒的不同将细胞分为对照组、阴性对照组和沉默组，每组3个复孔。对照组细胞不进行转染，阴性对照组和沉默组细胞分别转染control-siRNA和DHX15-siRNA质粒，转染操作严格按照Lipofectamine 3000转染试剂说明书进行。细胞转染后更换为含体积分数10%FBS的培养基继续恒温培养24 h。

1.2.3 qRT-PCR法检测各组ASMCs中DHX15 mRNA表达收集转染后24 h的各组细胞，根据TRIzol试剂盒说明书提取总RNA。取10μg总RNA，根据反转录试剂盒说明书反转录为互补脱氧核糖核酸（complementary deoxyribonucleic acid，cDNA），并进行qRT-PCR。DHX15上游引物序列为5′-GCGAAACAGAAGGTCTAC-3′，下游引物序列为5′-CTCATCTGCGGCTTTCTT-3′；内参GAPDH上游引物序列为5′-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3′，下游引物序列为5′-TGCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。qRT-PCR反应程序为95℃预热3 min，94℃变性20 s，59℃退火30 s，72℃延伸20 s，共35个循环。采用2－ΔΔCt法计算各组细胞中DHX15 mRNA相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.2.4 CCK-8实验检测各组ASMCs的增殖能力取各组转染24 h的细胞，按每孔1×106个细胞接种于96孔板中，每组设6个复孔，48 h后每孔加入10μL CCK-8试剂，并置于37℃孵育箱中避光孵育1 h。用酶标仪测定490 nm波长处各孔的吸光度值，以吸光度值代表细胞的增殖能力，吸光度值越大，增殖能力越强。实验重复4次，取均值。

1.2.5 Transwell小室实验检测各组ASMCs的迁移能力取各组转染24 h的细胞，以每孔1×104个细胞接种于6孔板中，于37℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养24 h，消化、离心细胞后，用无血清培养基稀释细胞，制成细胞悬液，并调整细胞密度为5×107L－1，以每孔200μL将细胞悬液加入Transwell小室上室底部，同时在Transwell下室加入100 mL体积分数10%的TBS和500μL细胞培养基。将Transwell小室继续置于恒温培养箱中培养，24 h后吸去Transwell小室上室中的多余液体，磷酸盐缓冲液清洗3次，用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分并擦去膜内侧的细胞，在上室中加入结晶紫染液，5 min后回收染液，用流水缓缓冲去染液，再次用棉棒在上室中轻轻转动，吸干水分。使用光学显微镜对上室迁移到下室的细胞数进行计数。实验重复3次，取均值。

1.2.6 Western blot法检测各组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK、p-p38蛋白表达收集各组转染24 h的细胞，采用放射免疫沉淀裂解液提取细胞总蛋白，并根据BCA蛋白检测试剂盒说明书测定蛋白浓度。取5μL蛋白上样，经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，用转膜仪将蛋白转移至PVDF膜，脱脂乳封闭1 h，磷酸盐缓冲液洗膜3次，分别加入p-p65（1∶800）、p-IκB（1∶1 000）、p-JNK（1∶500）、p-p38（1∶800）一抗，37℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶10 000），室温孵育2 h，再次用TBST洗膜，加入增强型电化学发光试剂显色，应用Image J软件检测各条带灰度值，以待测目的蛋白与内参GAPDH灰度值比值表示蛋白相对表达量。实验重复3次，取均值。

1.3 统计学处理应用GraphPad Prism 6软件进行数据统计与分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，两两比较采用独立样本t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组ASMCs中DHX15 mRNA相对表达量比较对照组、阴性对照组和沉默组ASMCs中DHX 15 mRNA相对表达量分别为2.9±0.13、3.11±0.10和1.05±0.11。对照组与阴性对照组ASMCs中DHX15 mRNA相对表达量比较差异无统计学意义（P＞0.05）。沉默组ASMCs中DHX15 mRNA相对表达量显著低于对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.2 3组ASMCs增殖能力比较对照组、阴性对照组和沉默组ASMCs细胞吸光度值分别为2.36±0.11、2.40±0.10和1.75±0.14。对照组和阴性对照组ASMCs增殖能力（吸光度值）比较差异无统计学意义（P＞0.05）。沉默组ASMCs增殖能力（吸光度值）显著低于对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 3组ASMCs迁移能力比较对照组、阴性对照组和沉默组ASMCs通过分子筛的细胞数分别为14.00±7.00、142.00±11.00和100.00±10.00个。对照组和阴性对照组ASMCs的迁移能力比较差异无统计学意义（P＞0.05）。沉默组ASMCs的迁移能力显著低于对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 3组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK、p-p38蛋白相对表达量比较结果见图1和表1。对照组和阴性对照组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK和p-p38蛋白相对表达量比较差异均无统计学意义（P＞0.05）。沉默组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK和p-p38蛋白相对表达量均显著低于对照组和阴性对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 3组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK和p-p38蛋白相对表达量比较Tab.1 Comparison of the relative expression levels of p-p65，p-IκB，p-JNK and p-p38 protein of ASMCs among the three groups（±s）

表1 3组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK和p-p38蛋白相对表达量比较Tab.1 Comparison of the relative expression levels of p-p65，p-IκB，p-JNK and p-p38 protein of ASMCs among the three groups（±s）

注：与对照组和阴性对照组比较a P＜0.05。

组别n 蛋白相对表达量p-p65 p-Iκ B p-JNK p-p38对照组3 1.68±0.08 1.48±0.11 1.88±0.10 1.47±0.07阴性对照组3 1.70±0.10 1.50±0.06 1.90±0.12 1.50±0.06沉默组3 1.26±0.02a 1.30±0.03a 1.24±0.02a 1.27±0.02 a

图1 3组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK和p-p38蛋白的表达（Western blot）Fig.1 Expression of p-p65，p-IκB，p-JNK and p-p38 protein of ASMCs in the three groups（Western blot）

3 讨论

DHX15是一种胞质RNA识别受体，能够激活干扰素调节因子3、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）和丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路，诱导干扰素β、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α分泌［14］，在调节细胞生长发育方面发挥重要作用［15］。DHX15参与多种细胞的生长，且在不同肿瘤中发挥着不同作用。JING等［17］研究发现，DHX15在前列腺癌中可刺激Siah2介导的雄激素受体泛素化，进而提高前列腺癌细胞的增殖能力。下调DHX15表达可促进食管癌细胞侵袭、转移［18］。上调胃癌细胞中DHX15的表达可抑制胃癌细胞的增殖和侵袭能力［19］。降低乳腺癌细胞中DHX15的表达可抑制乳腺癌细胞增殖，而DHX15与线粒体抗病毒信号蛋白共同表达可促进乳腺癌细胞增殖［14］。此外，有研究发现，非小细胞肺癌组织中DHX15表达水平显著高于癌旁正常组织，且在肺癌细胞中的表达量显著高于正常肺上皮细胞［16］。由此推测DHX15可能在包括哮喘在内的肺部疾病的发生、发展过程中发挥重要作用，因此，探究DHX15是否参与哮喘的发病过程，并了解其靶向调控机制，对临床上哮喘的治疗具有重要意义。本研究结果发现，沉默组ASMCs的增殖和迁移能力显著低于对照组和阴性对照组，提示DHX15可抑制TGF-β1诱导的ASMCs的增殖和迁移，DHX15可能对哮喘发生过程中呼吸道重塑具有重要的调节作用。

NF-κB是普遍存在的真核转录因子，其调节的大多数炎症细胞因子参与了哮喘的发病过程，包括细胞间黏附分子-1、肿瘤坏死因子-α和白细胞介素-8，在哮喘的发生和发展中发挥重要作用［20］。p65和IκB是NF-κB信号通路的关键蛋白。MAPK信号通路包含高度保守的丝氨酸／苏氨酸激酶，在细胞生长、增殖、分化、运动、凋亡和应激等多种过程中发挥作用。JNK和p38是MAPK信号通路的主要蛋白。有研究发现，抑制p38 MAPK对过敏性哮喘具有一定的抗炎作用，是哮喘治疗的潜在靶点［21］。在急性髓系白血病细胞中过表达DHX15可以激活NF-κB信号通路［10］，在抗病毒应答过程中DHX15可以激活NF-κB和MAPK信号通路［14］。本研究结果发现，沉默组ASMCs中p-p65、p-IκB、p-JNK和p-p38蛋白相对表达量均显著低于对照组和阴性对照组，说明在哮喘的细胞模型中，沉默DHX15的表达可抑制NF-κB和MAPK信号通路，提示DHX15可能通过调节NF-κB和MAPK信号通路对哮喘中ASMCs细胞的增殖和迁移产生影响，进而影响哮喘发展。

综上所述，干扰DHX15表达可显著抑制ASMCs的增殖和迁移能力，其机制可能与抑制NF-κB和MAPK信号通路有关。DHX15可能是哮喘呼吸道重塑过程中的重要基因，对DHX15功能和分子机制的研究对治疗哮喘具有重要意义。但本研究仅在细胞层面探究了DHX15对哮喘的影响，应进一步在动物模型中验证其作用，为临床治疗哮喘提供理论基础。