扭曲蛋白、波形蛋白、血管生成拟态在三阴性乳腺癌组织中的表达及临床意义

郭彬彬，郭 满，刘 明，张 浩

（1.新乡医学院研究生处，河南 新乡 453003；2.南阳市中心医院乳腺外科，河南 南阳 473000；3.南阳市中心医院疼痛科，河南 南阳 473000）

三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）约占所有乳腺癌的15.0%～20.0%［1］，其发病年龄较非三阴性乳腺癌（non-triple-negative breast cancer，N-TNBC患者）更趋年轻化［2］，且侵袭性更强，易发生肝、脑转移。TNBC患者由于缺乏雌激素受体（estrogen receptor，ER）、孕激素受体（progesterone receptor，PR）及人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的表达，因此内分泌治疗以及抗HER-2靶向治疗对其无效，化学治疗是唯一推荐的改善疾病结局的治疗方法，但易出现耐药［3］。已发生转移的TNBC患者的中位生存期仅为1 a，远低于N-TNBC患者［4］。扭曲蛋白（Twist）是上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）过程的重要驱动因子［5］，波形蛋白（vimentin）是EMT进程中的标志性分子。EMT过程中上皮细胞间黏附性减弱、失去极性，基底膜降解，细胞外基质重构，细胞骨架、形态及运动能力发生改变，使肿瘤细胞迁移及侵袭能力增高。血管生成拟态（vasculogenic mimicry，VM）通过肿瘤细胞自身变形和细胞外基质重塑构成血管样结构，覆盖VM通道的肿瘤细胞表达一些内皮细胞标志物［6］，提示VM过程类似于EMT，涉及从上皮特征到内皮表型的转变。本研究旨在通过检测Twist、vimentin、VM在TNBC组织中的表达，并结合临床病理特征及三者之间的相关性，初步探讨TNBC中EMT与VM的关系，为寻找TNBC的治疗新靶点及预后预测因子提供依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择2013年1月至2015年12月南阳市中心医院收治的TNBC患者为研究对象（观察组）。病例纳入标准：（1）经病理活检确诊为TNBC；（2）既往未接受过手术治疗、放射治疗及化学治疗。排除标准：（1）双侧乳腺癌；（2）合并其他脏器功能障碍；（3）合并炎性乳腺癌或其他部位恶性肿瘤。本研究共纳入120例TNBC女性患者，年龄28～76（51.86±9.07）岁，＞45岁87例，≤45岁33例；肿瘤直径T分期：T0～T1期49例，T2期68例，T3期3例；淋巴结转移48例，无淋巴结转移72例；TNM分期：Ⅰ、Ⅱ期共96例，Ⅲ期24例。另选择同期因乳腺良性疾病行手术治疗的30例患者为对照组，患者均为女性，其中乳腺纤维腺瘤19例，乳腺增生症11例；年龄30～67（46.37±10.14）岁。2组受试者年龄比较差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。本研究经南阳市中心医院伦理委员会批准，并取得患者知情同意。

1.2 主要试剂与仪器兔抗人Twist多克隆抗体及抗体稀释液、过碘酸-希夫（periodic acid-Schiff stain，PAS）染色液试剂盒购自北京博奥森生物技术有限公司，兔抗人vimentin单克隆抗体购自郑州赛诺特生物技术有限公司；2235型石蜡切片机购自德国徕卡公司，光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 免疫组织化学法检测TNBC组织及乳腺良性病变组织中Twist、vimentin表达取手术切除的观察患者癌组织和对照组患者良性病变组织，用体积分数10%中性甲醛固定，石蜡包埋，3μm连续切片，将切片置入60℃恒温箱中烘烤2 h，然后二甲苯浸泡15 min，更换二甲苯后再浸泡15 min，递减梯度乙醇脱去二甲苯并水化（无水乙醇、体积分数95%乙醇、体积分数75%乙醇、三蒸水），枸橼酸钠缓冲液（pH＝6.0）高压抗压修复，滴加体积分数3%过氧化氢溶液室温孵育20 min；磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，滴加一抗，置于湿盒中室温孵育2 h，PBS冲洗，室温下滴加二抗，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色，蒸馏水冲洗，苏木精复染，蒸馏水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察着色情况。以PBS代替一抗做阴性对照。兔抗人vimentin多克隆抗体采用即用型工作液，兔抗人Twist多克隆抗体采用浓缩型抗体1∶500倍稀释。

1.4 CD31及PAS双重染色法检测TNBC组织及乳腺良性病变组织中VM表达取手术切除癌组织和乳腺良性病变组织，用体积分数10%中性甲醛固定，石蜡包埋，3μm连续切片，将切片置入60℃恒温箱中烘烤2 h，然后置于二甲苯中浸泡15 min，更换二甲苯后再浸泡15 min，递减梯度乙醇脱去二甲苯并水化（无水乙醇、体积分数95%乙醇、体积分数75%乙醇、三蒸水），枸橼酸钠缓冲液（pH＝6.0）高压抗压修复；滴加体积分数3%过氧化氢溶液室温孵育20 min，PBS冲洗，滴加一抗（鼠抗人CD31单克隆抗体），置于湿盒中室温孵育2 h，PBS冲洗，室温下滴加二抗，DAB显色，待血管内皮细胞着色后，终止染色，将切片置于过碘酸溶液中反应10 min，蒸馏水冲洗，置于希夫液中，避光反应15 min；蒸馏水冲洗，苏木精复染，蒸馏水冲洗返蓝，梯度乙醇脱水、二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜观察有无VM。

1.5 结果判读Twist以细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞，vimentin以细胞质中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。按半定量积分法判断Twist、vimentin表达情况，根据染色强度及阳性细胞所占比例计分：无着色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；依据阳性细胞所占比例进行评分：阳性细胞所占比例＜15%为0分，阳性细胞所占比例15%～25%为1分，阳性细胞所占比例26%～50%为2分，阳性细胞所占比例51%～75%为3分，阳性细胞所占比例＞75%为4分。将着色强度和阳性细胞所占比例评分相加，总分＜4分为阴性表达，≥4分为阳性表达。VM以切片染色中出现樱桃红色管道，内壁无血管内皮细胞衬附，管道中有红细胞为阳性表达，否则为阴性表达。所有切片均由2位病理科医师独立判读，若结果存在差异则请第3位病理科诊断医师进行复核。

1.6 统计学处理应用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料以例数和百分率表示，组间比较采用χ2检验或Fisher′s精确概率法检验；等级资料比较采用秩和检验；相关性分析采用Spearman秩相关分析；采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存分析；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 Twist、vimentin、VM在TNBC组织和乳腺良性病变组织中的表达结果见图1。Twist、vimentin、VM在TNBC组织中阳性表达率分别为60.8%、25.0%、28.3%，在乳腺良性病变组织中的阳性表达率为分别13.3%、6.7%、0.0%（未检测到表达）；Twist、vimentin、VM在TNBC组织中阳性表达率均高于乳腺良性病变组织，差异有统计学意义（χ2＝21.675、4.807、10.991，P＜0.05）。

图1 TNBC及乳腺良性病变组织中Twist、vimentin、VM的表达Fig.1 Expression of Twist，vimentin and VM in TNBC tissues and lesion tissues of breast benign disease

2.2 Twist、Vimentin、VM与TNBC患者临床病理学特征的相关性结果见表1。TNBC组织中Twist的表达与患者的淋巴结转移和临床分期有关（P＜0.05），与患者的年龄、肿瘤直径、是否绝经无关（P＞0.05）；vimentin、VM的表达与肿瘤直径、淋巴结转移和临床分期有关（P＜0.05），与患者的年龄、是否绝经无关（P＞0.05）。

表1 Twist、vimentin、VM的表达与TNBC患者临床病理学特征的关系Tab.1 Relationship between the expressions of Twist，vimentin，VM and the clinicopathological characteristics of TNBC patients

2.3 TNBC中Twist、vimentin、VM表达的相关性TNBC患者癌组织中VM的表达与Twist、vimentin呈正相关（r＝0.277、0.363，P＜0.05），Twist的表达与vimentin呈正相关（r＝0.384，P＜0.05）。

2.4 Twist、vimentin、VM表达与患者预后关系结果见图2、3、4、5。120例TNBC患者随访9～83个月，平均随访55个月，生存率为70.8%（85／120）。Twist、vimentin、VM阳性表达患者的生存时间均显著短于阴性表达患者（χ2＝9.490、22.940、10.820，P＜0.05）。Twist、vimentin、VM均呈阳性表达患者的生存率仅为29.4%（5／17），三者不全呈阳性表达患者的生存率为77.7%（80／108）；Twist、vimentin、VM三者均呈阳性表达患者的生存率显著低于三者不全呈阳性表达患者（χ2＝44.620，P＜0.05）。

图2 TNBC组织中Twist阳性表达与阴性表达患者的生存时间Fig.2 Survival time of patients with Twist positive expression and Twist negative expression in TNBC tissues

图3 TNBC组织中vimentin阳性表达与阴性表达患者的生存时间Fig.3 Survival time of patients with vimentin positive expression and viment in negative expression in TNBC tissues

图4 TNBC组织中VM阳性表达与阴性表达患者的生存时间Fig.4 Survival time of patients with VM positive expression and VM negative expression in TNBC tissues

图5 TNBC组织中Twist、vimentin、VM表达均阳性患者和非均阳性表达患者的生存时间Fig.5 Survival time of patients with Twist，vimentin，VM positive expression and non-full positive expression in TNBC tissues

3 讨论

TNBC是一种异质性肿瘤，其对化学治疗有较高的反应性，但TNBC患者整体生存及预后较差。血管生成被认为是影响乳腺癌患者生存的不良预后因素，但针对血管生成过程中关键激酶的抗血管生成疗法未能明显改善患者的复发及预后。VM现象的发现解释了传统抗血管疗法失败的原因，使人们认识到肿瘤存在另一种不依赖于血管内皮细胞的血液供应模式［7-8］。有研究发现，相较于ER、PR、HER-2表达阳性的乳腺癌，VM现象在TNBC中更为常见［9］，或与其易转移复发及耐药不良生物学行为相关。Twist是诱导EMT的主要调控因子之一，对EMT过程的维持具有重要意义［10］。EMT被认为是癌症进展的核心组成部分［11］，在此过程中，上皮细胞的黏附力降低，而作为间质标志物的vimentin被上调，导致细胞迁移或转移至不同的器官［12］。LIANG等［13］研究发现，敲除MDA-MB-231细胞中的ZEB1因子后，vimentin表达下调，EMT被逆转，VM被抑制。本研究结果发现，Twist、vimentin在TNBC组织中的高表达与淋巴结转移、临床分期显著相关。且Twist与vimentin的表达存在正相关性，推测在TNBC发生发展进程中，肿瘤局部微环境发生改变，进而激活Twist的表达，使vimentin上调［3］，诱导EMT的发生。WAY等［14］研究发现，利用大黄素直接抑制头颈部鳞状细胞癌中Twist的表达，可引起vimentin mRNA和蛋白表达下调，与本研究结果相一致。在本研究中，VM在TNBC组织中的高表达与肿瘤直径、淋巴结转移、临床分期有关，且与Twist、vimentin表达呈正相关，这些结果说明Twist可促进间质标志物vimentin的表达，诱导EMT的发生，使肿瘤细胞之间的黏附性下降，加速TNBC细胞的变形，从而促进VM的形成，以获得所需的营养物质和氧气供应，加快TNBC的浸润、转移及耐药，与TNBC恶性程度相关。TAO等［15］在对MDA-MB-231细胞的研究中发现，长链非编码RNA TP73-AS1可以使Twist过表达，从而参与EMT，刺激VM的形成，该研究从细胞层面印证了本研究的结果。

本研究经平均55个月的随访发现，Twist、vimentin、VM阳性表达患者的生存期显著短于阴性表达患者，尤其是三者表达均为阳性的TNBC患者生存率仅为29.4%，远远低于TNBC总体生存率70.8%。因此，Twist、vimentin、VM的表达与TNBC的易转移复发及耐药等不良生物学行为相关，提示TNBC患者不良预后。

综上所述，Twist、vimentin和VM在TNBC组织中的表达高于乳腺良性病变组织，且三者表达呈显著正相关性，推测Twist可能通过调控vimentin的表达来诱导EMT，促进TNBC中VM现象的出现，从而介导TNBC细胞的侵袭、转移、耐药等病理现象的发生。另外，Twist、vimentin、VM表达阳性患者的生存时间显著短于表达阴性患者，提示检测Twist、vimentin、VM的表达对评估TNBC患者的预后可能具有指导意义。总之，本研究为TNBC潜在治疗靶点及预后预测分子的研究提供了线索和基础，但涉及的相关通路及分子机制尚需进一步深入研究来证实。