天麻素抑制miR-223-3p对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响

刘早阳，任福强

肺炎是肺炎链球菌感染所致的呼吸系统主要疾病之一，已严重影响了患者的生活质量。肺泡上皮细胞具有屏障保护功能，其凋亡是引发肺炎的重要原因之一；因而如何减轻肺泡上皮细胞损伤已成为治疗肺炎的关键。既往研究报道，部分中药可减轻肺炎链球菌感染引起的肺泡上皮细胞损伤[1-3]。天麻素是我国中药兰科天麻属植物天麻块茎的主要提取物，其可抑制氧化应激从而减轻小鼠星形胶质细胞损伤[4]；表明天麻素可通过抑制氧化应激及炎症反应等减轻细胞损伤，但其对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤尚未可知。miR-223-3p在肺炎患者中呈高表达，并可能作为诊断肺炎的生物标志物，但miR-223-3p在肺炎发生过程中的作用机制尚未阐明[5]。miR-223-3p在肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用机制，及其是否可作为天麻素减轻肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的作用靶点尚未可知。本研究采用肺炎链球菌诱导肺泡上皮细胞建立细胞损伤模型，探讨了天麻素是否可通过调控miR-223-3p的表达而影响肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞增殖、凋亡及炎症反应。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 天麻素购自昆明制药；肺炎链球菌购自美国ATCC；肺泡上皮细胞A549购自中国科学院细胞库；白细胞介素-10(IL-10)、IL-6检测试剂盒购自上海酶联生物；Trizol试剂、反转录、荧光定量PCR购自美国Theromo Fisher公司；Lipofectamine2000、MTT试剂(北京索莱宝公)司；凋亡检测试剂盒(美国Sigma)；兔抗人B细胞淋巴瘤/白血病相关X蛋白(Bax)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)抗体(美国Santa Cruz)；二抗(美国Abcam)；miR-223-3p寡核苷酸抑制物(miR-223-3p inhibitor)及阴性对照序列(anti-miR-NC)、miR-223-3p寡核苷酸模拟物(miR-223-3p mimic)及阴性对照mimic NC序列(miR-NC)均购自上海吉玛。

1.2方法

1.2.1实验分组：肺泡上皮细胞A549放入37℃水浴锅中融化1 min后加入含10%胎牛血清的DMEM培养液3 ml重悬；将细胞接种于培养瓶中，待细胞生长密度达到90%时，使用0.25%胰蛋白酶消化，按照1∶2的比例进行传代培养。取对数生长期A549细胞4×105个/ml接种于96孔板，每孔100 μl，加入肺炎链球菌(1×108CFU/ml )培养细胞24 h[6]记为模型组。同时将正常培养的细胞作为对照组。分别加入不同浓度的天麻素(2.5、5.0、10.0 μmol/L)与肺炎链球(1×108CFU/ml )培养细胞24 h[7]，分别标记为天麻素2.5 μmol/L组、天麻素5.0 μmol/L组、天麻素10.0 μmol/L组。使用不含胎牛血清的细胞培养液与anti-miR-NC、miR-223-3p inhibitor混合后室温孵育5 min(A液)，Lipofectamine2000转染试剂与不含胎牛血清的细胞培养液充分混合(B液)；A液与B液充分混匀后室温孵育20 min，并将其加入A549细胞，转染6 h弃上清液后更换正常培养液，并继续培养48 h，随后加入肺炎链球菌(1×108CFU/ml )培养细胞24 h，分别标记为anti-miR-NC组、miR-223-3p inhibitor组。采用上述转染方法将miR-NC、miR-223-3p mimic转染至A549细胞后加入含10.0 μmol/L天麻素与肺炎链球菌(1×108CFU/ml )培养细胞24 h，分别标记为天麻素10.0 μmol/L+miR-NC组、天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic组。

1.2.2细胞增殖检测：取各组A549细胞(4×105个/ml)接种于96孔板，每孔100 μl，于培养箱内继续培养24 h后，每孔加入MTT溶液20 μl，继续培养4 h后弃上清，每孔加入DMSO 150 μl，室温避光孵育5 min后应用酶标仪检测吸光度值(OD值)。

1.2.3细胞凋亡率检测：各组A549细胞加入预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后弃上清，加入500 μl结合缓冲液重悬细胞，分别加入5 μl Annexin V-FITC与5 μl PI，室温避光孵育10 min后，于1 h内应用FACS Calibur流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.2.4细胞中miR-223-3p的表达检测：以Trizol法提取各组A549细胞总RNA，反转录合成cDNA；按照qRT-PCR试剂盒配制反应体系，反应条件：95℃预变性2 min，95℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共循环40次。以罗氏LightCycler480荧光定量PCR仪检测miR-223-3p相对表达水平。

1.2.5IL-10、IL-6检测水平：取各组细胞培养上清液，采用ELISA法检测IL-10、IL-6的水平，严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.2.6Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白表达：采用蛋白提取试剂盒提取各组A549细胞总蛋白，取50 μg蛋白样品进行SDS-PAGE电泳反应，转膜、封闭，加入一抗稀释液(1∶1000)后孵育过夜(4℃)，使用TBST洗涤后加入二抗稀释液(1∶2000)，室温孵育1 h后滴加ECL，暗室内曝光显影后应用Image J软件分析各条带灰度值。

2 结果

2.1细胞增殖、凋亡及Bax、Bcl-2蛋白表达比较 与对照组比较，模型组OD值、Bcl-2蛋白表达水平显著降低，凋亡率、Bax蛋白表达水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，天麻素5.0、10.0 μmol/L组OD值、Bcl-2蛋白水平升高，凋亡率和Bax蛋白水平显著降低，且天麻素10.0 μmol/L组较天麻素5.0 μmol/L组上述指标变化更显著，差异有统计学意义(P<0.01)；但天麻素2.5 μmol/L组与模型组OD值、凋亡率、Bcl-2和Bax蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图1、2和表1。

表1 5组A549细胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表达水平比较

图1 流式细胞仪检测5组A549细胞凋亡情况

图2 5组A549细胞凋亡蛋白表达免疫印迹图

2.2肺泡上皮A549细胞中miR-223-3p表达及炎性因子水平比较 与对照组比较，模型组IL-6水平和miR-223-3p的表达水平显著升高，IL-10显著降低，差异有统计学意义(P<0.01)。与模型组比较，天麻素5.0、10.0 μmol/L组IL-6、miR-223-3p的表达水平降低，IL-10升高；且天麻素10.0 μmol/L组较天麻素5.0 μmol/L组上述指标变化更显著，差异有统计学意义(P<0.01)。但天麻素2.5 μmol/L组与模型组IL-6、IL-10及miR-223-3p表达水平比较差异无统计学意义(P>0.01)。见表2。

表2 5组A549细胞中miR-223-3p表达及炎性因子水平比较

2.3抑制miR-223-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞活性及凋亡的影响 与anti-miR-NC组和模型组比较，miR-223-3p inhibitor组OD值和Bcl-2蛋白表达水平升高，细胞凋亡率及Bax蛋白表达水平降低，差异有统计学意义(P<0.01)。模型组与anti-miR-NC组OD值、细胞凋亡率和Bcl-2、Bax蛋白表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3、4和表3。

表3 3组肺炎链球菌诱导的A549细胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表达水平比较

图3 流式细胞仪检测抑制miR-223-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡的影响

图4 抑制miR-223-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡蛋白免疫印迹图

2.4抑制miR-223-3p对肺炎链球菌诱导的A549细胞中炎性因子的影响 与anti-miR-NC组和模型组比较，miR-223-3p inhibitor组IL-10水平升高，IL-6水平降低(P<0.01)。见表4。

表4 3组肺炎链球菌诱导的A549细胞中炎性因子水平比较

2.5过表达miR-223-3p对天麻素处理肺炎链球菌诱导的A549细胞活性及凋亡影响 与天麻素10.0 μmol/L+miR-NC组进行比较，天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic组OD值和Bcl-2蛋白表达水平降低，细胞凋亡率和Bax蛋白表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见图5、6和表5。

表5 过表达miR-223-3p对天麻素处理的肺炎链球菌诱导的A549细胞活性、凋亡率及Bax、Bcl-2表达水平比较

图5 流式细胞仪检测过表达miR-223-3p对天麻素处理的肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡的影响

2.6过表达miR-223-3p对天麻素处理的肺炎链球菌诱导A549细胞炎性因子的影响 与天麻素10.0 μmol/L+miR-NC组比较，天麻素10.0 μmol/L+miR-223-3p mimic组IL-10水平降低，IL-6水平升高，差异有统计学意义(P<0.01)。见表6。

表6 过表达miR-223-3p对天麻素处理的肺炎链球菌诱导的A549中炎性因子水平比较

3 讨论

肺炎是临床常见的一种呼吸系统疾病，其发病率逐渐增高，肺炎的主要病原菌是肺炎链球菌[8]。肺炎链球菌感染后，肺泡上皮细胞凋亡率升高，从而使患者机体的抗感染能力降低[9]。绒毛大黄菌叶提取物、表没食子儿茶素没食子酸酯、皮质紫荆颗粒等均可减轻肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤[10]。天麻素对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞损伤的影响尚未阐明。

图6 过表达miR-223-3p对天麻素处理的肺炎链球菌诱导的A549细胞凋亡蛋白免疫印迹图

天麻素可减轻海马神经元细胞损伤，并可降低缺氧缺糖诱导的星形胶质细胞氧化损伤及抑制细胞凋亡[11-12]。天麻素具有抗炎、抗氧化及抗凋亡等作用，并可改善糖氧剥夺诱导的神经细胞损伤[13]。本研究结果显示，肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞活力降低，凋亡率明显升高，提示成功建立肺泡上皮细胞损伤模型。Bcl-2/Bax比值升高可促进细胞凋亡，而比值降低可抑制细胞凋亡[14]。本研究结果显示，模型组Bax表达水平升高，Bcl-2表达水平降低。提示天麻素可促进肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞的活力和增殖，并抑制细胞凋亡。IL-10属于炎性抑制因子，高水平的IL-10可减轻肺损伤；IL-6属于促炎因子，其水平升高可促进肺损伤[15]。本研究结果显示，模型组IL-10水平降低，IL-6水平升高，而天麻素5.0、10.0 μmol/L组可明显使IL-6水平降低，IL-10水平提高，提示天麻素可以抑制肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞炎症反应从而减轻炎性肺损伤。

miR-223-3p可通过调控炎性因子IL-6、IL-10、TNF-α及TLR4/TLR2/NF-κB/STAT3信号通路而参与脂多糖诱导人脂肪干细胞的损伤过程[16]。miR-223-3p负调控NLRP3炎性小体参与肝损伤过程[17]。本研究结果显示，模型组miR-223-3p表达水平升高，天麻素5.0、10.0 μmol/L组miR-223-3p表达水平降低。提示天麻素可通过下调miR-223-3p的表达发挥作用。本研究结果显示，抑制miR-223-3p表达可提高肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞活力，降低细胞凋亡率；并可使IL-10升高，IL-6降低。提示抑制miR-223-3p表达可促进肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞增殖及抑制细胞凋亡。本研究结果显示，miR-223-3p过表达可降低天麻素对肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞凋亡，减轻炎症反应。

综上所述，天麻素可通过下调miR-223-3p的表达而促进肺炎链球菌诱导的肺泡上皮细胞增殖及抑制细胞凋亡、炎症反应，从而减轻肺泡上皮细胞损伤。miR-223-3p可能作为天麻素治疗肺炎的潜在靶点，但关于其作用机制尚需进一步探究。