生物转化温室气体生产单细胞蛋白的研究进展

高子熹，郭树奇，费强，2

（1西安交通大学化学工程与技术学院，陕西西安710049；2陕西省能源化工过程强化重点实验室，陕西西安710049）

引 言

进入20世纪中叶后，随着人们在生产和生活中对石化燃料依赖性与日俱增，大量排放的温室气体使得全球气温持续增高，进而导致全球气候变暖和海平面上升[1]，由此引发的环境危机也日趋严重。与1960年相比，2013年大气中CO2浓度增加了30%[2]。在温室气体中，虽然CH4的排放量远不及CO2，但其排放来源广泛，其中包括来自气田、油田和煤矿等石化资源开发过程[3]，反刍动物养殖[4-5]以及污水处理[6]等活动。此外，如以20年时长计算，CH4的温室效应潜力值是等量CO2的80余倍[7]，即每排放一个当量的CH4，相当于排放80个当量的CO2。因此，降低温室气体排放及低碳发展已成为全球共识。我国已在2015年的巴黎峰会上明确承诺中国2030年单位GDP的CO2排放比2005年至少下降60%[8]。

随着现代生物技术的创新突破和节能减排理念的推广，温室气体已成为一种重要的可被微生物利用的碳源。目前，全球CO2年排放量超过1.00×105t的装置多达7400套[2]，运用碳捕集、利用及封存（carbon capture,utilization&storage，CCUS）技术[9]将其储存可用于微藻等光合微生物的生长，继而转化为高附加值化学品[10-13]。CH4可来源于天然气（页岩气）[14]、沼气[15-16]和可燃冰[17]等多种途径，且其储量均较为丰富，而微生物也可对CH4进行有效固定和高效转化[18-22]。同时，相较于化学利用方式，CO2和CH4的生物转化过程条件温和[23-24]、易于操作且碳源理论转化率可观[25-26]。因此，通过生物途径转化温室气体，不仅能够有效降低碳排放，而且可实现气体碳源的高值扩展利用。

近年来，全球人口增长使得肉类和乳制品等生活品需求持续增加[27]，可以预测以豆粕和鱼粉为主的动物饲料供应未来将出现较大缺口[25,28]。因此，单细胞蛋白（single cell protein，SCP）再度引起关注。SCP的应用历史久远，将晒干后的螺旋藻生物质作为食品[29]，同时酿酒酵母用于生产酵母提取物已有超过100年的历史[27]。SCP产自高蛋白含量的单细胞微生物[30]，主要用于动物饲料，部分真菌和微藻SCP还可作为食品添加成分[27,31]。SCP富含动物生长所需的多种氨基酸，尤其是包括蛋氨酸和赖氨酸等在内的必需氨基酸（essential amino acid，EAA），这些EAA不能由动物自身合成，需通过摄入食物进行补充。研究表明，用SCP饲料替代豆粕或鱼粉时，动物或鱼类生长几乎不受影响[32]，且其肉质及营养价值能得到一定提升[4]。此外，SCP生产原料来源广泛[27,33]，同时也能够克服传统动物饲料生产的局限性，即大豆种植占地和耗水量大[28]、饲料豆粕效率较低[34]及鱼粉产量受限[28]。温室气体成本低廉[35-36]、含量丰富[3,37-39]，且与粮食使用不产生任何竞争[35,40-42]。此外，利用大规模捕集大气中的温室气体或工业废气作为碳源生产SCP，还可促进低值废弃物[6,25,43]生物利用，减轻全球生态系统的负担。因此，温室气体的生物转化具有重要的经济价值和社会意义。至今，已发现有多种微生物可以利用CH4和CO2生产SCP（表1）。其中，好氧性甲烷菌以CH4为原料生产[57-59]，微藻以CO2为碳源进行代谢和生产[33,60-62]。本文主要介绍了好氧性甲烷菌和微藻中氨基酸合成的相关代谢路径、SCP生产工艺以及培养设备，并结合现有数据分别对以CH4和CO2为原料的好氧性甲烷菌和微藻SCP的生产过程进行了初步的经济可行性分析，探讨了利用温室气体合成SCP过程中存在的挑战以及未来的发展方向。

表1 微生物转化甲烷或二氧化碳生产SCP的概况Table 1 Current status of SCPproduction by microorganisms using CH 4 or CO2

1 以甲烷和二氧化碳为原料合成SCP的代谢调控

SCP为生长偶联型产品[63]，其主要成分为蛋白质[25]。因此，SCP合成的代谢调控以中心代谢途径和各氨基酸合成途径为主，注重提高生长速率、生产强度和EAA含量。

1.1 好氧性甲烷菌转化CH 4合成SCP

根据不同的甲醛利用途径，好氧性甲烷菌主要分为GroupⅠ和GroupⅡ[38]两大类。GroupⅠ型菌中，甲醛经单磷酸核酮糖循环（ribulosemonophosphatecycle，RuMPcycle）进入中心代谢（图1）。GroupⅠ型菌偏好氧气（O2）浓度较高的环境，生物质中85%～95%碳来源于CH4[64]。目前，以GroupⅠ型菌生产SCP的研究较多，主 要 为M.capsulatus（Bath）菌 株[45,65-66]。 而Methylomarinum vadi、Methylomarinovum caldicuralii和Methylomicrobiumburyatense等[67]GroupⅠ型菌也具有较高生长速率。GroupⅡ型菌包括Methylosinus trichosporium、Methylocystis和Methylocystisparvus等[67]，通过丝氨酸循环（serinecycle）同化甲醛[24,68]。GroupⅡ型菌CO2固定能力更强，部分菌CO2固定量可达细胞总碳的50%～60%[69]。因此，GroupⅡ型菌在沼气生物转化过程中具有可观潜力。此外，Verrucomicrobia菌株能够将CH4氧化为CO2后[70]，通过卡尔文循环（Calvin cycle）吸收[71]（图1）。在好氧性甲烷菌中，丙酮酸、2-脱氢-3-脱氧-7-磷酸庚酸（2-dehydro-3-deoxyarabino-heptonate 7-phosphate，2-DAHP）、丝氨酸、草酰乙酸（oxaloacetate，OAA）和α-酮戊二酸是氨基酸的重要前体[72]。其中，EAA主要由丙酮酸、2-DAHP和OAA合成[72]。

图1 好氧性甲烷菌合成氨基酸的代谢路径Fig.1 Metabolic pathway of synthesis of amino acids by aerobic methanotrophs

1.2 微藻转化CO2合成SCP

微藻包括微型藻和蓝细菌（即螺旋藻）[60]。各类微藻转化CO2合成氨基酸的代谢路径（图2）基本一致[73]。微藻通过卡尔文循环吸收CO2，碳流经3-磷酸甘油醛（G3P）进入中心代谢以合成各种氨基酸[74]。氨基酸前体主要包括磷酸烯醇式丙酮酸（phosphoenolpyruvate，PEP）、丙酮酸、OAA和α-酮戊二酸[75]。目前，用于生产SCP的微藻主要包括螺旋藻（Spirulina）[76]、小 球 藻（Chlorella）[60]、微 拟 球 藻（Nannochloropsis）[77]、鞭毛藻（Tetraselmis）[77]、巴夫藻（Pavlova）[61]和等边金藻（Isochrysis）[61]等。

图2 微藻合成氨基酸的代谢路径Fig.2 Metabolic pathway of synthesisof amino acids by microalgae

2 温室气体（CH4和CO2）的生物转化工艺与设备

作为胞内产物，SCP的生产能力与微生物生长水平密切相关，而培养环境决定着微生物比生长速率和细胞密度等生长指标，并间接影响SCP的经济竞争性[35,40,78]。由于CH4和CO2气体在水中溶解度相对于糖基类碳源较低，气液传质速率严重限制了微生物对上述碳源气体的转化[79]，进而会导致细胞密度较低，并增加了下游分离纯化过程的能耗。因此，针对CH4和CO2气体生物反应器的选型和优化可以直接提高气液传质速率以增强底物供给和消耗[80]。

2.1 温室气体（CH 4和CO2）的生物转化工艺

连续培养常用于保持高SCP生产强度[57,81]。气体底物和新鲜培养基以恒定速率输入培养设备，温度、pH和培养基组成需保持恒定，以确保生物质成分均一。培养液经离心、干燥和成型等单元得到产品。为减少营养盐浪费，上清液经简单处理后回流至培养设备[58]（图3）。

图3 好氧性甲烷菌(a)及微藻(b)SCP的生产工艺流程Fig.3 Process flow of the aerobic methanotrophs(a)and microalgae(b)SCPproduction,respectively

好氧性甲烷菌生长速率相对较高，有利于采用较高稀释率以提高生产强度。SCP生产过程中生热较多，对冷却水和设备的换热能力需求较高[82]。好氧性甲烷菌尺寸较小，增大了离心过程的能耗[82-83]。同时，该菌核酸含量较高，也需设置去除单元[27,84]。由于CH4的易燃易爆性质，整个生产过程需严格规范操作[85]。微藻生长速率较低，其SCP生产成本相对较高[83]。微藻培养过程需光照提供能量，阴影效应也会严重限制细胞密度[86]。由于微藻细胞壁很难被畜禽动物消化[31]，需对其进行破碎以便释放SCP。

2.2 好氧性甲烷菌培养设备

根据混合方式，好氧性甲烷菌培养设备可分为机械搅拌式和气动式。前者主要采用搅拌釜式发酵罐（stirred tank reactor，STR），后者包括鼓泡塔发酵罐（bubble column reactor，BCR）和气升式发酵罐（air lift reactor，ALR）。此 外，膜 生 物 反 应 器（membrane bioreactor，MBR）也具有较高的气液传质速率。之前的研究已对以上各类反应器的构造进行了详细的论述[79,87-88]，此处将简述其主要特点并进行总结和对比，讨论其在好氧性甲烷菌SCP生产中的应用。

2.2.1 搅拌釜式发酵罐 STR广泛应用于CH4生物转化过程[79]，其构造简便[88]、投资成本较低[89]。STR通过增加转速和优化搅拌桨构型产生小尺寸气泡，以增大气液传质的比表面积[79]。但其高径比较小[89]，气泡停留时间较短。而高速机械搅拌不仅增加能耗，其剪应力也对细胞产生损伤[90]，不利于工业化生产。基于STR的改良包括微纳米鼓泡发酵罐[79,91]和两相发酵罐[88]。微纳米气泡尺寸小而均匀稳定，其比表面积显著减小，停留时间较长[91]。两相发酵罐即添加对CH4或O2具有高吸附性的液体[92-93]或固体载体[94-95]，以强化气液传质，但生物质对于载体的高吸附性[88]极大地限制了其在实际生产中的应用。

2.2.2 鼓泡塔发酵罐 BCR无机械搅拌。气体从罐底部鼓入，在密度差的作用下以对流形式分散[87]，持续混合发酵液。与STR相比，其气液传质速率较高，且能耗显著较低[79]。在较大规模生产中，BCR的经济性显著优于STR[96]。然而，由于气泡相互作用和聚并等行为较复杂且不受控制，难以对BCR流体运动进行模拟，其设计和放大较为困难[89]。此外，BCR很少用于高黏度的发酵过程[96]。

2.2.3 气升式发酵罐 ALR在BCR基础上发展而来[80]，发酵液依靠气体喷射的能量和密度差循环流动。ALR分为内部循环和外部循环[87]，前者与BCR的流体运动状态非常相似。ALR内流体运动更具可控性，且发酵罐容积普遍较大；另一方面，ALR的研究尚处于初期，目前尚未在好氧发酵中得到广泛应用，且其投资费用高于BCR[89]。

2.2.4 强制环流发酵罐 强制环流发酵罐（forced circulation loop reactor，FCLR）是外部循环ALR的改良。通过泵送实现发酵液循环流动，气体沿其反方向喷射。静混合器不仅明显提升了高黏度发酵液的混合程度[89]，还可将聚并的气泡重新分散，以强化气液传质，其不需额外输入功率[97]。FCLR已广泛应用于好氧性甲烷菌SCP的工业化生产，Unibio和Calysta公司均已开发出U形环流发酵罐[98]（图4），SCP生产强度高达4 kg·m-3·h-1。

图4 U形环流发酵罐示意图（改自文献[98]）（新鲜培养基从U形部分的左端进入罐体，在旋桨泵的推动下形成逆时针环流。混合气原料从U形部分的右端喷射进入罐体，其运动方向与环流相反。U形部分设有几处静混合器，可将聚并的气泡重新分散。流体穿过静混合器时产生压力降，通过旋桨泵推动发酵液循环可补充该部分能量损失）Fig.4 Diagramof the U-loop bioreactor(adapted from Ref.[98])

2.2.5 膜生物反应器 MBR中无大量气泡产生，其可显著提高气液传质速率[79,99]。菌株快速生长易造成膜孔堵塞，使得实际传质速率远低于理论值[88]，且混合程度有限，不利于高密度发酵[100]，因此在好氧性甲烷菌SCP生产中应用较少。

2.3 微藻培养设备

微藻培养分为开放和封闭体系。开放体系适用于耐受高碱和高盐环境的藻株，包括螺旋藻和小球藻[76]。而封闭体系具有较好的灵活性，适用藻株范围更广[101]。

2.3.1 开放体系 开放体系具有低成本、易清洗[76]、建造便捷和低能耗[60]的特点，同时也存在难以实现长期稳定控制、生产速率低、占地面积较大和易遭受污染等缺陷[76]。其主要包括跑道池塘[61]和薄层反应器，此外，小球藻和杜氏藻的大规模生产多采用圆形搅拌池塘[102]和无混合池塘[77]。

跑道池塘（raceway pond）主要用于螺旋藻和小球藻生产[61]，是开放体系中生产强度最高、成本最低且应用最广的大规模培养设备[60]。其从底部鼓入空气，通过桨轮进行搅拌以避免微藻沉积[60]。目前，国内外大多数微藻SCP生产均采用跑道池塘[61,103]。薄层反应器（thin layer reactor）在跑道池塘基础上进行改良，微藻培养液从储罐持续泵送至平面。其光利用率高，最大光合效率为6.88%，微藻细胞密度可高达30 g·L-1。此外，其能耗较低[103]。开放体系在微藻SCP生产中的应用较成熟。然而，其对于藻株的限制较为严格。同时，微藻代谢工程改造[104-105]和新藻株开发[106]的相关研究正在兴起，传统的开放体系未来将很难满足微藻SCP生产的创新需求。

2.3.2 封闭体系 封闭体系多用于生产高附加值产品[101]。其具有光照表面积大、生产强度及传质速率高、不易受到污染等优势，但高投资成本极大限制了其应用[76]。封闭体系多为管式[86]和平面型[60]光生物反应器（photobioreactor，PBR）。管式PBR中培养液呈湍流，混合较均匀，且气液传质速率较高，易实现高密度培养，其生产强度可高达2760 g·m-3·d-1[103]。光合作用产生的O2易在管式PBR中积累，严重阻碍微藻生长，故需经常进行汽提，排出培养基中的O2

[60]。平面型PBR通过鼓入空气进行混合，光路径较短，且O2积累少，藻干重最高可达80 g·L-1[60]。但其易淤塞，进而降低光利用率，并增大染菌风险。目前，平面型PBR规模放大较难，运行成本高[103]。PBR多用于大规模微藻SCP生产过程的种子培养[77]。未来，新型PBR应具备管式PBR高生产强度优势，同时将成本降低至与开放体系相近[103]，目前尚无工业化实例[86,107]。

3 经济可行性比较与初探

全球饲料需求增长较快[28]，呈现供不应求的趋势[28,33]，以SCP逐渐替代传统饲料势在必行。目前，好氧性甲烷菌SCP生产规模仍有待开发[1,34]，而微藻产品的市场竞争力仍需提高[108]。因此，技术经济分析（techno-economic analysis，TEA）对于该行业的可持续发展尤为重要[35]。以下基于碳源成本进行初步的经济可行性分析，为后续研究提供一定参考。

3.1 好氧性甲烷菌SCP的经济可行性分析

美国页岩气产量爆发式增长，极大地改善了天然气供应[109]，继而拉低其价格[110]。2020年起，受新冠肺炎疫情蔓延扩散和石油输出国组织减产谈判破裂等因素影响，天然气价格不断走低[111]。美国亨利中心（Henry Hub）基准价格预计在未来几年内保持低位[112]。传统天然气属于石化能源，具有不可再生性，因此，寻找CH4替代来源相当重要。以工业废弃物生产沼气的成本可低至257.79 USD·(t CH4)-1[113]，加上装置固有的政府补贴[114]，成本可进一步降低。此外，石化燃料开采的伴生气多被燃烧或排空[71]，可运用高效的技术手段对其进行捕集[38]。为减少气体输配费用，SCP生产装置也可建于其邻近处。另外，相比于糖基碳源，CH4价格显著较低[35]。

好氧性甲烷菌的生物质得率和蛋白含量对SCP生产成本影响较大。合理选择菌株相当重要。GroupⅠ型好氧性甲烷菌的生物质得率[115]、蛋白含量和比生长速率[116]普遍高于GroupⅡ型菌。Khoshnevisan等[25]认为，好氧性甲烷菌生物质得率理论上可达1.78 g DCW·(g CH4)-1。因此，其SCP生产仍存在较大的发展空间，包括新菌株开发[117]、代谢工程改造[69]和发酵优化[21]。

按照现阶段的技术水平，即天然气（CH4体积比假定为90%）价格为2.00 USD·MMBtu-1(1 MMBtu=1.055 GJ)[35]，生物质得率和蛋白含量分别为1.03 g DCW·(g CH4)-1[25]和70%[97]，SCP提纯得率为62%～70%[27]及甲烷成本占比为26.92%[35]，好氧性甲烷菌SCP生产成本介于869～981 USD·t-1（100%蛋白，后同）。目前，饲料豆粕和鱼粉售价分别为1177 USD·t-1和2354 USD·t-1[40]，好氧性甲烷菌SCP对其具有明显的价格优势。2020年以来，天然气价格最低跌至1.33 USD·MMBTU-1[118]，其对应的SCP生产成本为578～652 USD·t-1。如将其触底价格设定为1.00 USD·MMBTU-1，价格优势将进一步扩大。Verbeeck等[40]认为沼气生产成本未来将低至38.56 USD·t-1，如以沼气（CH4体积比假定为60%）中的CH4为原料，好氧性甲烷菌SCP生产成本介于804～908 USD·t-1（图5），仍低于饲料市场价格。因此，好氧性甲烷菌SCP长期内可与传统饲料竞争。然其TEA及相关研究极少，且SCP生产和提纯等过程参数来源相当有限。因此，该估算的准确性有待检验，数据也需进一步补充和完善。

图5 不同原料价格下的好氧性甲烷菌SCP生产成本Fig.5 Cost of aerobic methanotroph SCPproduction under different feedstock prices NG—天然气;BG—沼气

3.2 微藻SCP的经济可行性分析

微藻培养的CO2主要来源于空气、火电厂废气和碳酸盐[119-120]。空气中CO2浓度极低，不利于微藻高密度培养[119]。采用碳酸盐作为碳源时，尽管避免了CO2运输等费用[121]，但其价格（152 USD·t-1[122]）显著较高，使得SCP生产成本大幅增加。火电厂废气中CO2浓度较高[123]，可运用碳捕集将CO2富集并用于生产。不同规模下，CO2捕集成本介于60～100 USD·t-1[2]，未来其有望降低至20 USD·t-1[36]。

藻株种类较多，蛋白含量分布较广，因此，应根据生产需求合理选择生产藻株[83]。螺旋藻和小球藻蛋白含量均较高，分别为46%～71%[76]和45%～68%[27]。栅藻、杜氏藻和雨生红球藻等蛋白含量较低[27]，可用于生产其他高附加值产品[61]。Williams等[124]指出微藻SCP提纯过程会损失约30%生物质。Davis等[78]认为微藻生产未来应注重提高生产强度，降低培养和富集等单元的成本，并寻求廉价碳源和营养盐来源。同时，应进行更多大规模微藻培养的研究以获得生产数据，使得TEA结果更加可靠。

现有TEA研究多将微藻SCP视为副产品（表2）。Matassa等[34]认为，微藻生物质生产成本介于474.21～2963.84 USD·t-1。其中，微藻SCP为低端产品，而生物柴油[133]和保健品（不饱和脂肪酸[12,60]、色素[12,61]和多糖[30]等）分别为中、高端产品。以微藻SCP为主产品时，基于现有技术（CO2价格、微藻生物质得率、蛋白含量、微藻SCP提纯得率和CO2成本占比分别为60～100 USD·t-1、0.53 g·(g CO2)-1[134]、70%、70%和37.9%[135]），生产成本为609.59～1015.99 USD·t-1（100%蛋白）。联产微藻SCP可降低中高端产品的生产成本[136]。此时，微藻SCP价格可低至100～400 USD·t-1[11,137-138]。Pikaar等[139]认为碳税可能逐渐增至150～220 USD·t-1。生产1 t微藻生物质至少可减排1.89 t CO2[134]，因此，微藻SCP生产成本降幅可达283.50～415.80 USD·t-1（图6），与传统饲料相比，其价格优势将更加明显。另外，微藻SCP的发展潜力较大，仅对全球7400处CO2年排放量超1.00×105t的装置[2]进行碳捕集并用于微藻SCP生产，便可至少满足2025年全球50.68%的饲料需求[28]。

表2 以SCP为主/副产品的微藻生物质生产数据Table 2 Data of microalgae biomass production with SCP as the main-or by-product

图6 不同情况下的微藻SCP生产成本Fig.6 Cost of microalgae SCPproduction under different scenarios

4 结论与展望

现阶段CH4和CO2的大量排放已对人类生态环境造成了严重的、不可逆的影响[140]。利用合成生物学和发酵工程等现代生物技术将上述两种温室气体作为生产SCP的原料[1,27,33]，具有重要的经济价值和社会意义。目前，GroupⅠ型好氧性甲烷菌[67,116,141]、螺旋藻和小球藻等微藻合成的SCP具有较高的蛋白含量及EAA占比[25,66,116]。运用代谢调控等手段可在不影响微生物生长的前提下，进一步提高细胞密度和各类氨基酸前体的碳流强度。此外，基于ALR改良的FCLR等新型气体生物反应器也能有效强化气液传质，提高好氧性甲烷菌对CH4碳源的利用效率[79,88,98]。微藻培养主要分为开放和封闭体系[76]，基于开放体系的微藻培养多用于大规模微藻SCP生产[61]，但细胞密度等指标普遍较低[60]，而基于封闭体系的微藻培养具有明显的生产强度优势，但成本较高[76]。因此，兼具管式PBR的高生产强度和跑道池塘的低成本的微藻培养设备对微藻SCP的商业化推广具有重要的作用。近年来，碳捕集技术的革新[9]和碳税的引入[119,142]已显著降低了CO2价格，并提高了微藻SCP的市场竞争力。而天然气（页岩气）的价格优势和沼气生产的工艺提升，也使得好氧性甲烷菌SCP的工业化生产具有较好的发展潜力。随着微生物代谢网络优化和生物反应器设计改良的快速发展，基于温室气体的SCP生产有望缓解全球日益紧张的饲料供应形势。