iPSC-MSCs与hUC-MSCs治疗大鼠膝骨关节炎的实验研究

张陆 刘志昂 姜岩 刘军

郑州人民医院，河南 郑州 450003

膝骨关节炎为一种退行性病变，临床表现为缓慢发展的膝关节疼痛、压痛、僵硬、关节肿胀、活动受限和关节畸形等。随着人口老龄化的不断加剧，膝骨关节炎的发病率不断增高，目前尚无有效的治疗方法。临床上常用的治疗方法是通过关节腔注射润滑剂或应用非甾体抗炎药，以缓解患者的痛疼及相关症状，晚期患者可以采取关节置换等手术治疗[1]。尽管如此，还是不能对软骨损伤及炎症进程进行逆转[1]。干细胞抑制治疗是骨关节炎的一种新的治疗手段。间充质干细胞(MSCs)为一种多能干细胞，自我更新和多向分化能力强，可以分化为成骨细胞、软骨细胞、基质细胞等多种细胞[2]。骨髓来源间充质干细胞(BMSCs)是研究较早的一种MSCs，但是由于来源有限且取材具有侵袭性，已被其他来源MSCs逐渐取代。hUC-MSCs具有分化潜力大、增殖能力强、免疫原性低、取材方便、无道德伦理问题限制的特征，有可能成为BMSCs的理想替代物[3]。iPSC-MSCs是一种新型干细胞，是成熟体细胞通过转录重编、培养、扩增诱导成的MSCs，相对于传统的干细胞，其增殖潜能更大，可能是一种很有前途的替代细胞来源[4]。因此，本研究将基于动物实验，探讨iPSC-MSCs与hUC-MSCs对大鼠膝骨关节炎的治疗作用及可能机制，为临床干细胞移植治疗骨关节炎提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：SD大鼠50只，雌雄各半，重量为170 ～210 g，由郑州大学实验动物中心提供，实验动物许可证号：SYDWXK(豫)2018-011，合格证号：344002837650。

1.1.2药品与试剂：iPSC-MSCs由河南金泰生物技术股份有限公司提供，IPMC批号：2018110432，规格：4×108个细胞/mL；hUC-MSCs由河南金泰生物技术股份有限公司提供，批号：UMC2018091466，规格：4×108个细胞/mL，经鉴定iPSC-MSC与hUC-MSCs均为第3代次细胞；玻璃酸钠注射液由华煕福瑞达生物医药有限公司生产，批号：20181085H，规格：25 mg:2.5 mL/支；抗MMP-13多克隆抗体、抗CollagenⅡ多克隆抗体、抗ADAMTS-5多克隆抗体均由Abcam公司提供，批号分别为ab1846、ab1890、ab1822。

1.2 方法

1.2.1膝骨关节炎模型的建立：SD大鼠禁食12 h后采用Hulth法建立膝骨关节炎模型。将大鼠麻醉后仰卧于台上，对右侧后肢膝关节进行常规消毒，在髌骨旁的内侧将膝关节切开，显露，将内侧副韧带切断后将关节腔进行打开；将内侧的半月板切除；在手术中保证关节面没有受到损伤。止血后对切口进行缝合。假手术组不切断前后交叉韧带、内侧副韧带及半月板。术后每只大鼠给予肌注青霉素20万IU，1次/d，共3 d。术后1周，对每只大鼠进行运动训练，加重膝骨关节炎。

1.2.2分组与给药：按照随机数字法将50只SD骨关节炎模型大鼠分为模型组、iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组、玻璃酸钠组、假手术组，每组10只。模型组与假手术组通过关节腔注射50 μL的生理盐水；iPSC-MSCs组与hUC-MSCs组分别通过关节腔注射50 μL(2×106个细胞/mL)的iPSC-MSCs (4×108个细胞/mL)与hUC-MSCs (4×108个细胞/mL)；玻璃酸钠组通过关节腔注射玻璃酸钠注射液，50 μL/次，1次/周，共5次。将所有大鼠在给药5周后予以处死。

1.2.3观察指标：①膝关节直径差值：采用游标卡尺对术侧膝关节与对侧膝关节的直径进行测量，计算差值；②膝关节腔Kellgren-Lawrence分级的评价：给药1周后，对每组大鼠术侧膝关节进行X线检查，采用Kellgren-Lawrence分级评分系统评价膝骨关节炎的严重程度，从轻到重分为：0级(正常的膝关节)、I级、II级、III级、IV级(最严重程度的膝骨关节炎)；③膝关节Pelletier评分：处死大鼠后取其膝关节，在显微镜下对关节腔内的软骨退变情况进行观察，进行膝关节Pelletier评分，评分越高表示软骨受到损伤的程度就越高；④膝关节病理组织学评分：处死大鼠后取其股骨内髁关节面，经处理后采用Mankin标准进行病理组织学评分，评分越高表示软骨结构受到破坏的程度就越高；⑤MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5水平的检测：处死大鼠后取其膝关节，采用免疫组织化学法检测大鼠膝关节MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5的表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组膝关节直径差值的比较

与假手术组比较，模型组的膝关节直径差值[(2.45±0.62) mm]明显增大，膝关节发生变形，说明膝骨关节炎模型建立成功。iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组与玻璃酸钠组的膝关节直径差值分别为(1.10 ±0.38) mm、(1.29 ±0.46) mm、(1.50±0.35) mm，与模型组比较，均明显降低(P<0.05)；iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组与玻璃酸钠组之间的的膝关节直径差值比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2 各组膝关节腔Kellgren-Lawrence分级的比较

与假手术组比较，模型组膝关节腔Kellgren-Lawrence分级明显降低(P<0.05)；iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组与玻璃酸钠组的膝关节腔Kellgren-Lawrence分级均明显优于模型组(P<0.05)，iPSC-MSCs组的膝关节腔Kellgren-Lawrence分级明显优于hUC-MSCs组与玻璃酸钠组(P<0.05)，hUC-MSCs组与玻璃酸钠组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组膝关节腔Kellgren-Lawrence分级情况

2.3 各组膝关节Pelletier评分的比较

与假手术组比较，模型组的膝关节Pelletier评分[(3.35±0.77)分]明显增高(P<0.05)；iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组与玻璃酸钠组的膝关节Pelletier评分分别为(1.19±0.53)分、(2.08±0.60)分、(1.99±0.59)分，与模型组比较，均明显降低(P<0.05)；iPSC-MSCs组的膝关节Pelletier评分均明显低于hUC-MSCs组与玻璃酸钠组(P<0.05)，hUC-MSCs组与玻璃酸钠组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4 各组膝关节病理组织学评分的比较

各组膝关节病理组织学检测结果见图1。假手术组、iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组与玻璃酸钠组膝关节的骨组织表现正常，软骨细胞呈较为均匀地分布，潮线表现为完整且平滑；模型组膝关节的软骨边缘出现部分缺损，软骨细胞成簇分布，排列比较紊乱，可见炎性细胞浸润，潮线漂移。

图1 各组膝关节病理组织学检测结果 (HE染色×100)

与假手术组比较，模型组的膝关节病理组织学评分[(5.46±1.33)分]明显增高(P<0.05)；iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组与玻璃酸钠组的膝关节病理组织学评分分别为(1.80±0.47)分、(3.32±1.15)分、(3.90±1.20)分，与模型组比较，均明显降低(P<0.05)；iPSC-MSCs组的膝关节病理组织学评分均明显低于hUC-MSCs组与玻璃酸钠组(P<0.05)，hUC-MSCs组与玻璃酸钠组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.5 各组MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5水平的比较

与假手术比较，模型组的CollagenⅡ水平明显降低(P<0.05)，MMP-13与ADAMTS-5水平均明显升高(P<0.05)。iPSC-MSCs组、hUC-MSCs组及玻璃酸钠组的CollagenⅡ水平明显高于模型组(P<0.05)，MMP-13与ADAMTS-5水平均明显低于模型组(P<0.05)；iPSC-MSCs组的CollagenⅡ水平明显高于hUC-MSCs组及玻璃酸钠组(P<0.05)，MMP-13与ADAMTS-5水平均明显低于hUC-MSCs组及玻璃酸钠组(P<0.05)；hUC-MSCs组的CollagenⅡ水平明显高于玻璃酸钠组(P<0.05)，两组之间MMP-13与ADAMTS-5水平的比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组MMP-13、CollagenⅡ及ADAMTS-5表达水平的比较

3 讨论

膝骨关节炎是以关节软骨发生缺失、关节软骨基质发生降解等为主要特征的一种退行性关节疾病，其病理生理机制比较复杂，大多数学者[5]认为是机械性与生物性因素共同作用的结果。关节软骨细胞及基质的合成与降解发生紊乱，是造成膝骨关节炎的重要关键[6]。Hulth法是建立膝骨关节炎动物模型的经典方法，膝骨关节炎动物模型的特点与人自发性膝骨关节炎的病理生理比较相似[7]，因此常被用于动物基础实验研究。

hUC-MSCs具有较高的分化潜能，可向多个方向进行分化。有报道[8]指出，从人脐带中分离出的MSCs，其细胞含量、增殖能力优于骨髓MSCs，免疫原性比骨髓MSCs低，并且具有取材方便、无伦理学争议等优点，越来越受到研究工作者们的关注。iPSCs是通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为的多能性干细胞，iPSCs技术可以用患者自己的体细胞制备专有的干细胞，从而大大降低了免疫排斥反应发生的可能性[9]。iPSC-MSCs的岀现，在干细胞、表观遗传学以及生物医学等研究领域都引起了强烈的反响，使人们对多能性的调控机制有了突破性的新认识，进一步拉近了干细胞与临床疾病治疗之间的距离[10]。

本文基于动物实验，探讨iPSC-MSCs与hUC-MSCs对大鼠膝骨关节炎的治疗作用及可能机制。结果显示，iPSC-MSCs与hUC-MSCs均能明显降低膝骨关节炎大鼠的膝关节直径差值、膝关节Pelletier评分、膝关节病理组织学评分，改善膝关节腔Kellgren-Lawrence分级；iPSC-MSCs组膝关节Pelletier评分、膝关节病理组织学评分均明显低于hUC-MSC组，膝关节腔Kellgren-Lawrence分级明显优于hUC-MSC组。说明iPSC-MSCs与hUC-MSCs能够对术后关节不稳起到明显的缓解作用，有效地保护膝关节面之间摩擦而引起的骨质增生和硬化；能够对关节腔结构、减少骨赘形成和骨质硬化起到明显的改善作用；能够明显减少软骨层缺损，改善潮线完整度，修复后的软骨具有与正常软骨相似的典型透明特征。提示，iPSC-MSCs与hUC-MSCs均对大鼠膝骨关节炎具有明显的治疗作用，iPSC-MSCs优于hUC-MSCs。

CollagenⅡ主要由软骨细胞产生，是一种高分子蛋白质，丝状的胶原蛋白纤维与弹性蛋白及多糖蛋白相互交织形成网状结构，产生一定的机械强度[11]；MMP-13可降解多种软骨细胞外基质成分，能作用于CollagenⅡ，MMP-13水平增高可促进其网状结构发生裂解，造成关节软骨发生缺损[12-13]；ADAMTS-5能够通过对aggrecan(一种关节软骨基质的组成成分，对保持软骨的弹性及完整性具有重要作用)进行降解而损伤软骨结构的完整性及关节功能，与膝骨关节炎的严重程度呈现正相关性[14-15]。本研究中，iPSC-MSCs与hUC-MSCs均能明显增高膝骨关节炎大鼠的CollagenⅡ水平，降低MMP-13与ADAMTS-5水平，而iPSC-MSCs组的CollagenⅡ水平明显高于hUC-MSCs组、MMP-13与ADAMTS-5水平明显低于hUC-MSCs组，说明iPSC-MSCs与hUC-MSCs均上调大鼠膝关节软骨基质中CollagenⅡ的表达水平，下调MMP-13与ADAMTS-5的表达水平，抑制软骨的降解，起到保护软骨的作用，而iPSC-MSCs优于hUC-MSCs。

综上所述，iPSC-MSCs与hUC-MSCs对大鼠膝骨关节炎具有明显治疗作用，iPSC-MSCs优于hUC-MSCs，其作用机制可能与上调CollagenⅡ水平及下调MMP-13、ADAMTS-5水平有关。