非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增方法的建立

王宏燕 ， 杨作丰 ， 李秀梅 ， 杨利敏 ， 边 际 ， 董 娜 ， 张立国

(1. 辽宁省农业发展服务中心 ， 辽宁 沈阳 110032 ； 2. 洛阳现代生物技术研究院有限公司 ， 河南 洛阳 471000 ； 3. 中国科学院微生物研究所 ， 北京 海淀 100080 ； 4. 沈阳市农业综合行政执法队 ， 辽宁 沈阳 110031)

非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fever virus，ASFV)引起的猪的烈性传染病，通常表现出高热、全身出血、呼吸障碍和神经症状等主要临床症状，具有病程短、病死率高等特征[1]。该病是我国一类动物疫病，也是世界动物卫生组织(OIE)法定报告的动物疫病之一，ASFV 不感染人，对人的健康不构成威胁。目前，针对ASF防控，尚无有效的商品化疫苗。ASFV基因组为线状双股DNA，全长170～190 kb，整个基因组有151个开放阅读框(ORF)，可以编码150～200种蛋白质，其中B646L基因编码的p72蛋白是ASFV的一种主要的衣壳结构蛋白，是重要抗原之一[2]。

环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新型核酸扩增技术，在恒温条件下利用Bst DNA聚合酶和根据靶序列设计的3对特殊引物，特异性识别靶序列上的6个独立区域[3]，启动循环链置换反应产生哑铃状DNA，并以自身为模板，进行DNA合成延伸，形成茎-环DNA结构。本试验基于LAMP技术原理，利用实时荧光技术，建立了一种快速、灵敏的ASFV检测方法，该方法特异性强、灵敏度高，为ASFV临床诊断提供了一种可靠的方法和手段。

1 材料与方法

1.1 试验材料 猪伪狂犬活疫苗和猪圆环病毒2型活疫苗，均购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所；猪瘟活疫苗，购自中牧实业股份有限公司；高致病性猪呼吸与繁殖综合征活疫苗(JXA1-R)，购自广东大华农动物保健品股份有限公司；猪细小病毒病灭活疫苗(YBF01株)，购自易邦生物有限公司；37 个临床样品由中国动物疫病预防控制中心惠赠。

1.2 主要试剂盒耗材 Bst enzyme为商品化DNA聚合酶，购自美国NEB公司；D-I矿物油，购自生工生物工程(上海)股份有限公司；引物订自生工生物工程(上海)股份有限公司；病毒 DNA/RNA 提取试剂盒(R4410-03)，购自Magen公司。

1.3 仪器与设备 -80 ℃冻存柜、高速台式离心机、微量移液器、超微量分光光度计，均购自美国Thermo Fisher公司；漩涡混合器，购自德国IKA公司；恒温LAMP扩增仪，购自杭州奥盛仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 引物设计 根据非洲猪瘟病毒B646L基因的保守结构域设计3对引物，包括1对内引物(FIP与BIP)、1对外引物(F3与B3)和1对环引物(LF与LB)，LAMP TaqMan探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，具体引物序列见表1。取3对引物(FIP、BIP、F3、B3、LF和LB)干粉和LAMP TaqMan探针干粉，按说明书分别加入适量无菌纯化水，溶解混匀，得到各引物溶液，置-20 ℃保存。

表1 LAMP引物序列Table 1 LAMP primer sequences

1.4.2 病毒DNA的提取 ASFV DNA提取参照Magen公司的病毒DNA/RNA 提取试剂盒(R4410-03)说明书进行操作，将提取的DNA用DNA 酶水溶解，于-80 ℃保存。

1.4.3 阳性质粒的构建 以非洲猪瘟病毒B646L基因为模板，用特异性引物F：5′-TTAGGTACTGTAACGCAGCACAGCT-3′、R：5′-ATGGCATCAGGAGGA-GCTTTTTG-3′进行PCR反应，将目的片段回收后与 pMD18-T 载体进行连接，转化DH-5α感受态细胞后挑菌培养，PCR及LAMP方法验证克隆。

1.4.4 ASFV-R-Mix的配制 称取2.4 g Tris，0.37 g氯化钾，0.12 g硫酸镁，100 μL吐温-20，7.029 g甜菜碱，溶于80 mL纯化水，依次加入终浓度为1.4 mmol/L dNTPs溶液、0.2 μmmo/L外引物溶液、1.6 μmol/L内引物溶液、0.8 μmol/L环引物溶液、LAMP TaqMan探针，加入无菌纯化水定容至100 mL， 经过0.22 μm滤器过滤除菌，分装至2 mL蓝盖可立冻存管中，1.1 mL/管，-20 ℃保存。

1.4.5 Bst enzyme的制备 用于制备本试剂盒的Bst enzyme为商品化DNA聚合酶(美国NEB公司)，按使用说明书用纯化水稀释至4×106/L，分装至0.5 mL白盖可立冻存管中，-20 ℃保存。

1.4.6 反应体系的建立 22 μL ASFV-R-Mix、1 μL Bst enzyme和2 μL DNA模板加入同一个PCR管，混匀，用10 μL D-I矿物油轻轻加至PCR管液面，将反应混合物置于到恒温扩增仪反应槽中，65 ℃恒温反应12 min，荧光采集周期20 s。

1.5 特异性试验 以猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(High pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP-PRRSV)、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvovirus，PPV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2) 5种病原疫苗为特异性对照，分别以上述病毒的核酸为检测模板，验证该检测方法的特异性。

1.6 灵敏度试验 用超微量分光光度计测定质粒浓度，将质粒进行10倍倍比稀释，稀释度从10-1到10-5，浓度分别为1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、 100 fg/μL，每个稀释度取2 μL作为模板加入到 1.4.6 建立的反应体系中进行恒温扩增，验证该检测方法的敏感性。

1.7 临床样品检测 用建立的AFSV real-time LAMP检测方法对37个临床样品进行检测，评价并比较实际应用性。

1.8 与其他检测方法的比较分析 为确定本试验的特异性、灵敏度和实际应用效果，用OIE推荐的实时荧光定量PCR检测方法[4]，对1.5、1.6及1.7中的模板进行扩增反应。

2 结果

2.1 Real-time LAMP检测ASFV的特异性 以CSFV、HP-PRRSV、PRV、PPV和PCV2五种病原疫苗的DNA为对照检测模板，超纯水为阴性对照，测试本试验建立的ASFV real-time LAMP检测方法的特异性。结果如图1所示，试验结果显示：ASFV real-time LAMP检测方法仅对阳性对照出现特异的S型扩增曲线，阴性对照和上述5种病原疫苗均未发生扩增。与OIE推荐的实时荧光定量PCR方法的检测结果一致,见表2。结果表明本试验建立的real-time LAMP检测方法具有良好的特异性。

图1 非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增方法特异性试验Fig.1 Specificity test of real-time LAMP for detection of ASFV

表2 非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增与OIE推荐的实时荧光定量PCR特异性结果对比Table 2 Comparison of specificity between ASFV real-time LAMP and qPCR recommended by OIE

2.2 Real-time LAMP检测 ASFV的灵敏度 构建含ASFV real-time LAMP扩增靶位点的质粒，用超微量分光光度计测定质粒浓度，将质粒进行10倍倍比稀释，稀释度从10-1到10-5，分别作为模板进行扩增，每个样本进行3次重复试验，以纯化水作为阴性对照，结果见封二彩版图2。与OIE推荐的实时荧光定量PCR检测上述各稀释度模板的结果比较见表3。结果显示，ASFV real-time LAMP方法能检测到最低质粒浓度为1 pg/μL，与OIE推荐的实时荧光定量PCR方法灵敏度相当。

图2 非洲猪瘟病毒实时荧光环介导等温扩增敏感性试验Fig.2 Sensitivity test of real-time LAMP for detection of ASFV

2.3 临床样品的检测 通过对37个临床样品进行检测，结果见表4，本试验建立的real-time LAMP与OIE推荐的实时荧光定量PCR方法检出的结果一致。

表4 临床样品ASFV检测结果Table 4 Results of clinical samples for detection of ASFV

3 讨论

我国非洲猪瘟疫情防控形势十分复杂严峻。自2018年8月3日辽宁省沈阳市沈北新区某养殖场被确诊发生我国第一起非洲猪瘟疫情以来，非洲猪瘟已在我国大部分省市发生，给我国养猪产业造成了毁灭性的打击。目前，非洲猪瘟没有有效的治疗药物，也没有有效的灭活疫苗或弱毒疫苗，一旦确诊感染，扑杀并无害化处理是防止病原扩散最有效的控制手段。

分子生物学方法是ASFV重要的诊断工具。本试验将TaqMan探针应用于LAMP扩增体系后，与采用SYBR Green、浊度等各种显色方法相比[5]，能产生高特异性的信号，为LAMP技术更加广泛的应用于临床诊断提供数据支持。本试验通过特异性、灵敏性试验，对猪瘟病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型5种病原疫苗的检测均为阴性，特异性良好；且在DNA模板浓度为1 pg/μL时仍能扩增出目的片段，灵敏度良好。与OIE推荐的实时荧光定量PCR相比，其特异性和敏感性相当，对37份临床样品的检测结果一致。

本试验建立的real-time LAMP方法与常规PCR方法比较，LAMP引物针对模板6个区段，其特异性更高，无假阳性；扩增过程无需变性与退火，反应时间仅需12 min，适宜高通量大规模筛查，可减少人工操作，结果判定准确可靠，其技术优势可在快速诊断和疫情防控工作中进一步发挥作用。