西尼罗河病毒RT-RPA检测方法的建立及初步应用

吴 江 ， 林彦星 ， 贾 鹏 ， 黄超华 ， 史卫军 ， 曹琛福 ， 曾少灵 ， 孙 洁 ， 阮周曦 ， 林永涛 ， 花群义

(深圳海关动植物检验检疫技术中心 ， 广东 深圳 518045)

西尼罗河病毒(West Nile virus，WNV)是一种可以引起西尼罗河热的单链RNA虫媒病毒，可感染人类、马及鸟类[1]，属于黄病毒科、黄病毒属。库蚊是WNV传播的主要媒介，鸟类(乌鸦、鸽子)是其自然宿主，病毒可通过“鸟-蚊-鸟、人、其他动物”的生物传播链在大自然界生存。该病毒可以直接导致鸟、鸡等小型动物死亡，人、马患上可导致脑炎甚至死亡[2-4]。1937年，WNV在乌干达西尼罗河区域发现并命名[5]。2000年，以色列累计发现400多例WNV神经侵袭性病例[6]。2017年，美国报道2 000多例感染WNV的病患中，出现神经侵袭性症状的接近2/3[7]。鉴于WNV严重威胁人类健康和畜牧业发展，世界卫生组织已将该病毒疾病列为当前世界的重大流行病之一[8]。目前，我国尚未出现人感染WNV的病例报道，但WNV潜在的宿主鸟类和可能的传播媒介蚊子在我国是存在的，频繁的国际旅行、候鸟迁徙及进口动物及动物产品贸易，使WNV传入风险日益提高，该病已成为我国重点防范的外来人兽共患病之一。如何快速有效地诊断该病，防止该病从国外传入我国，已引起大众关注。

目前，WNV病原体检测方法包括传统的病毒分离、普通RT-PCR、实时荧光定量PCR、Lamp、二代测序技术等。但是，这些检测方法操作相对比较复杂，对技术人员的要求较高，检测时间相对较长，不适用于现场检测。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification，RPA)是由多种酶和蛋白参与的，可在37～42 ℃恒温条件下进行检测技术[9-10]。该项技术可替代一般PCR的热循环解链过程，具有耗时短、成本低、检测场地不受限制等优点[11]。为此，本研究以WNV为研究对象，筛选特异高效的RPA引物和探针，建立了快速、特异检测WNV的实时荧光逆转录重组酶聚合酶扩增(RT-RPA)方法。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 自动磁珠提取纯化设备、微量核酸定量Qubit 4及病毒RNA提取试剂盒，均购自赛默飞世尔科技公司；M-MLV逆转录酶及酶抑制剂，购自日本TaKaRa公司；T16-ISO等温扩增检测仪，购自澳大利亚AXXIN公司；TwistAmpTMexo试剂盒，购自英国Twista公司。

1.2 病原样品和临床样品 本试验用到的猪病和牛病灭活抗原：蓝舌病毒(BTV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)，都保存于本中心实验室；WNV的e基因的质粒标准品WNV-e由本中心构建；牛或猪临床灭活样品由本中心病免室收集。

1.3 引物和探针合成 根据WNV的保守区域e基因序列，使用Primer Explorer Version 4(http://primerexplorer.jp/e)软件，在线设计引物和探针。引物和探针合成均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.4 核酸提取 按照抽提试剂盒的操作说明，使用自动磁珠提取纯化系统，从牛或猪血液样品及其他灭活病毒抗原中提取核酸，-80 ℃保存备用。

1.5 反应体系和条件 本反应使用TwistAmpTMexo试剂：将试剂盒中RPA冻干酶粉反应管放置于冰上，加入溶解缓冲液29.5 μL，M-MLV逆转录酶(200 U/μL) 1 μL,10 μmol/L的上下游引物各2.1 μL， RNA酶抑制剂(40 U/μL) 1 μL，10 μmol/L的探针0.6 μL，DEPC水和核酸模板12.2 μL。充分混合匀均上述试剂后加入280 mmol/L的醋酸镁溶液2.5 μL，共50 μL。配置好上述反应液后，立即放入恒温扩增仪扩增。反应温度选择39 ℃，反应时间选择20 min。

1.6 引物探针筛选 将合成的多条探针和多对引物进行配对组合，分组进行RT-RPA检测，筛选较优组合。

1.7 特异性试验 应用建立的RT-RPA方法，对本中心保存的BVDV、JEV、PRRSV、CSFV和BTV等核酸模板进行特异性检测，以WNV-e质粒标准品为阳性对照，设立无核酸水模板为空白对照，验证WNV的RT-RPA检测方法的特异性。

1.8 灵敏度试验 应用建立的RT-RPA方法，用DEPC水对WNV-e质粒标准品进行10×倍比稀释，每个检测孔收集FAM荧光信号，各取2 μL模板(稀释度100～10-6)进行RT-RPA试验,以确定本方法最低检测限。同时，使用李林海等[12]建立的WNV实时荧光PCR方法进行平行检测，比较2种方法的灵敏度。

1.9 重复性试验 选取3个稀释梯度(10-1～10-3)的WNV-e标准品作为模板，采用创建的实时荧光RT-RPA进行检测，重复检测6次，分析反应体系的稳定性。

1.10 临床检测 应用建立的方法对本中心保存的72份牛或猪的临床样品进行测试，设置WNV-e质粒标准品为阳性对照，DEPC水作为阴性对照。同时采用李林海等[12]建立的实时荧光PCR方法测试，对比2种方法的检测结果，并计算2种方法的符合性。

2 结果

2.1 引物探针的筛选 采用矩阵法两两组合筛选结果表明，F4/R5这对引物和P2探针组合扩增效率最高(表1)。

表1 RT-RPA方法最佳引物及探针核苷酸序列Table 1 Optimal primer and probe nucleotide sequence for RT-RPA method

2.2 特异性试验 使用稀释度为10-1的WNV-e质粒标准品和提取的BVDV、JEV、PRRSV、CSFV和BTV的核酸为模板，应用建立的RT-RPA方法扩增。结果显示，WNV-e模板在反应后220 s收集到FAM荧光信号，且随着反应进行荧光信号不断增强，出现典型的S型扩增曲线；其他猪或牛病原核酸模板和空白对照均未出现扩增荧光曲线(中插彩版图1)。表明本方法特异性较强，能准确检测到WNV，与其他病原核酸无交叉反应，与试验设计相符。

图1 实时荧光RT-RPA特异性检测Fig.1 Specificity test of real-time RT-RPA assay1：WNV-e； 2：BVDV； 3：JEV； 4：PRRSV； 5：CSFV； 6：BTV； 7：阴性对照； 8：空白对照1：WNV-e； 2：BVDV； 3：JEV； 4：PRRSV； 5：CSFV； 6：BTV； 7：Negative control； 8：Blank control

2.3 灵敏度试验 使用微量核酸定量Qubit 4荧光计，测得WNV-e标准品初始拷贝数为5.25×106拷贝/μL。 选择稀释度100～10-6的7个WNV-e标准品作为模板，使用创建的实时荧光RT-RPA方法检测。结果显示(中插彩版图2)，WNV-e质粒标准品在稀释度为10-4时检测仍有荧光曲线，对应最低检测拷贝数为5.25×102拷贝/μL。使用李林海等[12]建立的实时荧光定量PCR检测法开展检测，结果显示(中插彩版图3)，WNV-e标准品在稀释度为10-5时检测出现荧光曲线，最低检测拷贝数为5.25×101拷贝/μL。虽然本研究创建的RPA方法灵敏度比实时荧光定量PCR法低1个数量级，但是，RT-RPA方法优势独特，从4 min开始可观察到扩增曲线，反应条件简单且无需大型仪器设备，检测时间不到荧光PCR的1/3，检测效率更高。

图2 实时荧光RT-RPA灵敏度检测Fig.2 Sensitivity test of real-time RT-RPA assay1～4：WNV稀释度分别为10-1、10-2、10-3、10-4； 5～6：WNV稀释度分别为10-5、10-6； 7：空白对照1-4:WNV dilution were 10-1，10-2，10-3，10-4，respectively； 5-6:WNV dilution were 10-5，10-6，respectively； 7：Blank control

图3 实时荧光PCR方法检测结果Fig.3 Results of real-time PCR method1～6：WNV-e稀释度分别为100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-51-6：WNV-e dilution were 100，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5， respectively

2.4 重复性试验 将10-1、10-2、10-3三种浓度的WNV-e质粒分别用RT-RPA法重复检测6次，均可观察到相应的荧光曲线，相同浓度模板检测结果一致，表明本方法重复性能够满足检测需要。

2.5 临床样品检测 采用建立的RT-PCR方法和实时荧光PCR方法，对本中心实验室收集的72份灭活牛或猪的临床样品进行检测，分别以WNV-e质粒为阳性对照。结果显示，WNV有13份阳性核酸出现典型的扩增曲线，结果与实时荧光定量PCR法符合率为100%。

3 讨论

西尼罗河病毒一直威胁着人类健康和畜牧业的发展，一旦暴发可导致严重的公共卫生问题。近年来，由于人员流动和国际贸易增加，面临WNV入侵的风险不断加大。截至目前，我国没有发现人感染WNV的病例报道，但已有研究人员在新疆部分区域的蚊虫样品中分离出与1999年美国暴发的相同进化分支的WNV[13]。为此，我们仍需要为WNV的入侵做好应对。目前，尚无针对WNV的有效治疗措施，对此病的预防需要依赖实验室诊断和养殖过程防控。因此，建立一种简便、快捷、准确的WNV检测方法，将有助于尽早阻断病原体的传播，降低人类感染风险，减少经济损失。

RPA是一种在恒温条件下，通过与荧光探针结合即可实现对核酸扩增实时监测的检测新技术[14]。在反应体系中加入逆转录酶，可一步快速扩增RNA模板，总反应时间少于20 min。结合荧光探针使用的实时RPA检测技术，可以在便于携带的恒温扩增荧光检测器中直接读取检测结果。目前，RPA引物探针的设计尚无专门的程序。本研究通过大量试验筛选引物及探针组合，建立了WNV实时荧光RT-RPA方法。结果表明，本研究建立的RT-RPA法操作简便，特异性强，与常见猪病病毒核酸检测没有出现交叉反应；灵敏性比实时荧光定量PCR稍低，可检测最低拷贝数为102拷贝/μL的WNV阳性核酸。本研究建立的WNV RT-RPA方法比李林海等[12]建立的实时荧光定量PCR法低1个数量级的原因，可能为RT-RPA扩增体系中存在大量蛋白酶干扰反应的进行[15]。本研究所建立的实时荧光RT-RPA法反应程序简单，无需复杂仪器设备；反应时间短，反应时间不到实时荧光PCR的1/3。本研究将72份临床样品用于所建立方法的临床应用，2种方法的检测结果一致，表明该方法的实用性较强。

综上所述，本研究建立的检测西尼罗河病毒RT-RPA检测方法操作简单，反应灵敏，结果可靠，仪器依赖度低，适用于WNV监测、基层实验室或出入境口岸对WNV的现场快速检测，为WNV病毒病的防控提供了技术支撑。