PPARγ甲基化与慢性肾脏病患儿肾间质纤维化的关系*

潘竞, 覃远汉, 蒋玲, 席志杨, 涂立, 蹇淑娟

广西医科大学第一附属医院儿科(广西南宁 530021)

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是肾间质由大量成纤维细胞聚积形成，是各种慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)进展到终末期的共同病理表现，与肾功能损害密切相关，RIF发展的程度越高预示着肾功能损害程度越重。过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator aetivated receptor gamma，PPARγ)是转录因子核受体家族成员之一，参与细胞分化、脂质代谢、炎症、免疫调节等机体多种功能调节，且与糖尿病、肥胖、动脉粥样硬化等疾病密切相关[1-2]。Lu等[3]研究发现，PPARγ的激活在改善RIF的发展和治疗CKD方面具有潜在的价值。为此，我们采用重亚硫酸盐扩增子测序(BiSulfite Amplicon Sequencing，BSAS)的方法，进行PPARγ甲基化与CKD患儿RIF状态的关系分析，从表观遗传学范畴探讨PPARγ甲基化可能参与RIF发生、发展的机制。

1 资料与方法

1.1 对象与分组 选取广西医科大学第一附属医院儿科病房2014—2019年经肾穿刺活检术确诊的各类CKD患儿共75例，其中，病理表现为RIF(RIF组)33例；非RIF(非RIF组)42例。选择本院体检中心正常健康儿童51例作为正常对照组(正常组)。本研究已获本院伦理委员会审核批准，同时患儿监护人或患儿本人知情同意。

1.2 主要试验材料 血液基因组DNA提取试剂盒(TIANGEN，中国)；NanoDrop 2000(Thermo Fisher Scientific)；MiSeq v.3试剂盒(Illumina，San Diego，CA，美国)；EZ DNA甲基化-GOLD试剂盒；HT1缓冲液(Illumina，San Diego，CA，美国)；Qubit 2.0(Invitrogen，美国)；Gnome Size Selector磁珠(Huijie，Wujiang，中国)；安捷伦2100生物分析仪(Agilent Technologies)；Illumina MiSeq台式测序仪；Miseq平台(Illumina，San Diego，CA，美国)。

1.3 DNA亚硫酸氢盐转化和亚硫酸氢盐特异性PCR 收集各组患儿外周静脉EDTA抗凝血约2 mL，按照DNA提取试剂盒说明书提取患儿血液基因组DNA，应用重亚硫酸氢盐甲基化转化修饰后进行PCR扩增，上游引物5′-TGTTAAAAAGGGTAAAGGTTTTGAG-3′，下游引物5′-CTCTACTAATTTATAAAACCCAAAATAA-3′，片段长度367 bp。反应体系为25 μL: Takara Ex Taq HS (RR006A)0.25 μL,10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,dNTP Mixture (2.5 mM each)2 μL,DNA甲基化转化溶液(Template)1.5 μL,上游引物(10 μmol/L)0.5 μL,下游引物(10 mmol/L)0.5 μL,无酶水17.75 μL，反应条件：95℃预变性5 min，58℃变性20 s，72℃退火20 s，72℃延伸20 s，共进行45个循环;将PCR产物用1%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.4 甲基化测序文库制备 将上步产物根据Miseq平台使用TruSeq DNA PCR的文库制备技术，取500 ng DNA，进行末端修复，3′末端加A及adaptor连接，使用磁珠纯化PCR文库，并以10 μL MilQ洗脱。用生物分析仪对双链文库进行质量检查，以确定文库大小和摩尔浓度，并通过qPCR进行文库效率检查，引物为测序文库通用引物，最后将DNA文库在MilQ中稀释至2 nmol/L。

1.5 甲基化测序 DNA文库取5 μL (4 μm)放入1.5 mL离心管内添加5 μL NaOH(0.2N)变性5 min，用测序稀释液稀释至1 000 μL，将稀释后的文库加入到测序试剂盒指定区域内，放入仪器内启动测序程序进行测序反应。

2 结果

PPARγ基因启动子扩增片段中，各甲基化位点相对位置分别为第71位、第85位、第163位、第257位。RIF组、非RIF组及正常组间PPARγ基因各位点甲基化情况，见表1。与正常组相比，在第71和第85两个位点RIF组和非RIF组甲基化比例均显著低于正常组(H=-23.18、-21.05、-28.21、-27.60，P<0.05)，而RIF组和非RIF组两组间差异无统计学意义(H=-2.13、-0.61,P>0.05)，在第163和第257两个位点中，各组PPARγ基因甲基化均差异无统计学意义(H=0.90、2.60，P>0.05)。

表1 各组PPARγ基因在不同位点甲基化情况

3 讨论

表观遗传学机制是通过对DNA修饰从而改变基因表型，而DNA甲基化是真核生物调控基因表达的主要表观遗传机制之一[4]。在真核生物中，DNA甲基化在CpG二核苷酸(称为CpG岛)发生最为普遍，CpG岛是长度为0.5～2 kb的区域，存在于人类所有基因高达50%的5′端启动子区域中，在DNA甲基转移酶作用下，甲基从辅助因子S-腺苷-L-蛋氨酸(SAM)转移到DNA中胞嘧啶环的第5位碳原子并与其共价键结合，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine，5mC)，即DNA甲基化[5-7]。在DNA甲基化转移酶的作用下，DNA启动子构象发生改变，导致基因失活，在生物体内mRNA表达降低，反之，低甲基化可能使基因在生物体内mRNA表达升高。

DNA甲基化已被证实参与多种组织器官纤维化疾病发生、发展，如研究发现，在慢性丙型肝炎[8]中，RASSF1A和P16基因启动子甲基化频率增高；特发性肺纤维化(IPF)[9]全基因组甲基化分析中，发现多个基因启动子位点发生甲基化改变，且与基因mRNA表达显著相关；肝纤维化小鼠模型的肝脏组织[10]中，钙调磷酸酶调节剂1(RCAN1)的亚型RCAN1.4基因启动子发生异常甲基化，致RCAN1.4 mRNA表达降低；单侧输尿管梗阻(UUO)诱导的小鼠肾脏纤维化[11]中，Klotho基因启动子发生高甲基化，使Klotho基因表达异常。以上均表明在不同疾病致纤维化发生进展过程中，伴有基因启动子异常甲基化。

DNA甲基化与肾脏疾病发生、发展有关[12]。蔡雅萍等[13]研究发现，在CKD5期患者中去甲肾上腺素转运体基因(SLC6A2)启动子甲基化频率异常升高，提示SLC6A2基因异常甲基化与CKD5期有关。陈静等[14]报道，CKD患者肾脏组织中外周血单个核细胞(PBMC)Klotho基因启动子甲基化率升高，且与肾小管间质纤维化面积呈正相关，均提示提示DNA甲基化可能参与CKD发生、发展。Li等[15]发现，肾细胞癌中，PON1基因呈现高甲基化，抑制肾细胞癌组织中PON1基因mRNA及蛋白表达下调，促使肾癌细胞的迁移、侵袭和增殖，使用PON1基因去甲基化制剂后，抑制肿瘤的生长，表明PON1基因甲基化参与肾细胞癌发生、发展；在CKD肾性贫血患者[16]中，促红细胞生成素(EPO)和缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)基因的启动子区高度甲基化，并且随着CKD的进展，这些基因的表达被沉默。

PPARγ具有抗细胞增殖、炎症反应和组织纤维化的多效性功能，可能参与肾损伤后的继发性缺氧、缺血、再生和修复过程[17]。Panchapakesan等[18]发现，PPARγ激动剂能限制近端小管的促炎症反应，早期应用能限制糖尿病肾病的发展。Kohno等[19]报道，PPARγ激动剂能抑制单侧输尿管梗阻模型中RIF的程度，表明PPARγ激动剂能减轻RIF和炎症反应；研究发现[20]，PPARγ激动剂罗格列酮通过PPARγ调节转化生长因子-1(TGF-1)和肝细胞生长因子(HGF/c-Met)，对高草酸尿产生抗氧化作用，减轻晶体沉积。

研究发现，PPARγ基因异常甲基化参与多种疾病发生、发展[21]。如在慢性乙型肝炎急性肝衰竭患者[22]中，PPARγ启动子甲基化明显减弱，PPARγ mRNA表达水平升高；在结肠癌(colon cancer，CC)患者血液及癌组织样本[23]中，检测出PPARγ启动子甲基化水平增加，甲基化患者的PPARγ mRNA及蛋白表达较未出现甲基化患者低，表明PPARγ启动子甲基化能抑制PPARγ mRNA及蛋白表达；在乳腺癌患者血清[24]中，检测到PPARγ基因甲基化程度增高；在猪肌内前脂肪细胞[25]中，由甲基化转移酶3A(DNMT3A)介导PPARγ基因甲基化水平上调，并显著抑制PPARγ基因表达，抑制肌内前脂肪细胞分化。

因此推测，在PPARγ基因参与CKD病致肾脏纤维化疾病发生、发展过程中，发生了PPARγ基因启动子异常甲基化。在本研究中，RIF组和非RIF组PPARγ甲基化比例较正常组均显著降低，因此推测，低甲基化状态可能导致PPARγ基因在CKD病中表达改变，PPARγ参与肾脏抗炎抗纤维化作用机制可能与PPARγ低甲基化有关。本研究结果显示，CKD患儿中， RIF组及非RIF组PPARγ甲基化比例在第71及第85位点较正常组均明显降低，但RIF组及非RIF组之间甲基化比例无明显差异，提示PPARγ低甲基化状态可能参与患儿CKD的发生发展，但并非RIF这一阶段所特有，可能在CKD早期中，PPARγ低甲基化状态就已出现。因此，随着患儿CKD病程的逐渐进展，可能伴随着PPARγ低甲基化，但具体发生在哪一阶段目前尚未清楚。Harald等[26]研究发现，肾功能中度或重度受损的患者PPARγ mRNA表达明显高于肾功能正常者，而在肾脏组织中PPARγ的mRNA表达改变是否与PPARγ低甲基化有关，还需进一步实验证实。

综上所述，PPARγ甲基化水平降低可能在RIF出现前已发生，PPARγ低甲基化可能参与CKD发生、发展。