揭阳地区妊娠期妇女定植无乳链球菌分子流行特征及耐药特点

徐勇锋, 黄旭东, 陈楚兵, 黄燕青, 黄春明, 洪钦明

1揭阳市中医院检验科(广东揭阳 522000)； 2揭阳市人民医院检验科(广东揭阳 522095)； 3揭阳市妇幼保健计划生育服务中心检验科(广东揭阳 522031)； 4揭阳市第三人民医院检验科(广东揭阳 522071)； 5揭阳市揭东区人民医院检验科(广东揭阳 515500)； 6揭阳市榕城区妇幼保健计划生育服务中心检验科(广东揭阳 522000)

无乳链球菌(streptococcus agalactiae)又称为B群链球菌(group B streptococcus, GBS),妊娠晚期生殖道中无乳链球菌的定植，是引起产后宫内感染和新生儿肺炎、脑膜炎以及菌血症的重要原因[1]。研究表明[2]，定植无乳链球菌的序列型(sequence type, ST)和血清型分布、耐药性以及毒力等流行特征均存在地理区域性差异。近年来，关于揭阳地区的定植无乳链球菌的分子流性特征鲜有报道。本研究拟对揭阳地区6家医院分离的定植无乳链球菌，进行多位点序列分型(multilocus sequence type, MLST)、分子血清学分型、耐药性等流行特征调查，为该地区定植无链球菌引起的妊娠不良结局的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本及菌株 本研究共收集妊娠35～37周妇女的阴道直肠拭子1 076份，来源于2018年1月至2019年12月间就诊于揭阳市中医院、揭阳市人民医院、揭阳市妇幼保健计划生育服务中心、揭阳市第三人民医院、揭阳市揭东区人民医院和揭阳市榕城区妇幼保健计划生育服务中心等6家医院的非重复患者。标准菌株肺炎链球菌ATCC49619、无乳链球菌ATCC12403和A909均购自美国典型菌种保藏中心。

1.1.2 试剂和仪器 LIM肉汤、M-H血琼脂平板和哥伦比亚血琼脂平板(广州迪景公司)、药敏纸片(英国Oxiod公司)、细菌基因组DNA提取试剂盒和Premix Taq(大连TaKaRa公司)。VITEK 2全自动细菌鉴定/药敏分析仪及相关检测试剂(法国梅里埃公司)、PCR扩增仪(美国ABI公司)、核酸凝胶电泳仪和凝胶成像分析系统(美国Bio-Rad公司)。MLST和所有基因检测的引物均由上海生工公司合成。

1.2 方法

1.2.1 标本处理及菌株鉴定 将收集的阴道直肠拭子放入LIM肉汤，在37℃、5% CO2条件下，孵育24 h。将肉汤转种于血平板上，在37℃、5% CO2条件下，孵育18 h，挑取菌落形态疑似无乳链球菌的菌落进行鉴定。同时满足以下条件者可鉴定为无乳链球菌：(1)菌落有β溶血环；(2)涂片革兰染色为革兰阳性球菌，呈链状排列；(3)CAMP实验呈阳性；(4)经VITEK2细菌鉴定仪鉴定结果为无乳链球菌。

1.2.2 DNA提取 参照TaKaRa试剂说明的要求和操作步骤，提取细菌基因组DNA，置于-80℃待用。

1.2.3 MLST分型 采用PCR技术，参照Jones 等[3]的报道，扩增7个管家基因(adhP,pheS,atr,glnA,sdhA,glcK和tkt)。扩增后的产物送上海生工公司进行测序分析。所获得的序列经MEGA6软件剪齐后，上传至pubmlst在线数据库，通过7个管家基因的等基因数得出各菌株的ST。用eBURST version 3.1软件对所有ST进行克隆群(clonal complexes，CCs)分析。将各类型ST的7个管家基因进行拼接后，采用MEGA6软件用UPGMA法进行菌类分析。

1.2.4 分子血清分型 采用多重PCR技术，参照Imperi等[4]的报道，扩增荚膜多糖(capsular polysaccharide，CPS)合成基因，通过琼脂糖凝胶电泳确定各实验菌株的血清型。分子血清分型以标准菌株ATCC12403(血清学 Ⅲ型)和A909(血清学Ⅰa型)参考菌株。

1.2.5 抗菌药物敏感试验 采用K-B法，检测各菌株对青霉素(10 units)、红霉素(15 μg)、克林霉素(2 μg)、氯霉素(30 μg)、左氧氟沙星(5 μg)、万古霉素(30 μg)和四环素(30 μg)的敏感性。参照临床和实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)抗菌药物敏感试验指南(http://www.clsi.org)2020版的试验要求和药敏标准。质控菌株采用标准菌株肺炎链球菌ATCC49619。

1.2.6 D-抑菌圈试验 参照李东等[5]的报道，对红霉素耐药且克林霉素敏感或中介的实验菌株检测是否有红霉素耐药菌株诱导克林霉素耐药。D-抑菌圈试验阳性菌株，克林霉素修正为耐药。根据D-抑菌圈试验的结果，对红霉素和克林霉素耐药表型进行分型。

1.2.7 耐药基因检测 参照何其励等[6]的报道，采用PCR技术，扩增所有试验菌株的红霉素(ermA、ermB和mefA/E基因)和克林霉素(linB基因)耐药基因，通过扩增产物电泳结果确定耐药株是否携带相应的耐药基因。

1.3 统计学方法 药敏结果采用WHONET5.6软件进行分析。用SPSS 22.0统计软件进行统计学分析，计数资料以例数或百分比表示，组间比较采用2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 菌株鉴定结果 本研究从6家医院1 076份非重复标本中，共检出103株无乳链球菌，该地区妊娠妇女无乳链球菌携带率为9.6%(103/1 076)。

2.2 MLST结果 如图1所示，本研究共从103株定植无乳链球菌种检出21个ST,其主要ST包括ST19(32.0%)、ST17(18.4%)、ST103(6.8%)和ST23(6.8%)，其他ST所占比例均<5.0%。21个ST来源于8个CC，主要的CC包括CC19(39.8%)、CC17(18.4%)、CC103(16.6%)和CC23(8.8%)。

注：ST，序列型；CC,克隆群；该图采用UPGMA法进行聚类分析

2.3 分子血清型结果 本次共检出5种血清型，分别为Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ，所占比例依次为：24.3%(25/103)、12.6%(13/103)、5.8%(6/103)、49.5%(51/103)和7.8%(8/103)。如图1所示，Ⅲ型主要分布于ST19(43.1%)和ST17(37.3%)、Ⅴ型主要分布于ST19(87.5%)、Ⅱ型主要分布于ST23(66.7%)；而Ia和Ib存在于多种ST中。

2.4 抗菌药物敏感试验结果 103株试验菌株对青霉素和万古霉素均敏感(敏感率为100.0%)，对红霉素、克林霉素、四环素耐药率以及多重耐药率均>60.0%(表1)。本次未发现对红霉素、克林霉素和氯霉素中介耐药的菌株。不同血清型菌株对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐药率以及多重耐药率均存在统计学差异(P<0.05)(表1)。

表1 不同血清型无乳链球菌间的耐药率比较 株(%)

2.5 红霉素和克林霉素耐药基因检测结果 本研究中的103株试验菌株中，对红霉素耐药的74株菌株均检出耐药基因，ermA、ermB和mefA/E分别占16.2%(12/74)、83.8%(62/74)和25.7%(19/74)；对克林霉素耐药的62株菌株中linB基因检出率为54.8%(34/62)；此外，有3株对红霉和克林霉素均敏感的试验菌株检出mefA/E基因。见表2。

表2 103株无乳链球菌耐药表型、基因型与ST相关关系

2.6 红霉素耐药表型、基因型与ST的相关性 如表2所示，103株无乳链球菌分为5种表型，部分ST的表型和基因型较为集中，如ST17均为cMLSB型且基因型相同、ST103和ST651均为S型基因型也同；但部分ST的基因型和表型较为多样，如ST19菌株。对红霉素耐药的74株菌株，cMLSB、iMLSB和M型等3种耐药表型分别占73.0%(54/74)、8.1%(6/74)和18.9%(14/74)。

3 讨论

无乳链球菌定植是引起妊娠不良结局的重要危险因素[7]。一项纳入390篇文献，涵盖85个国家、299 924名孕妇的荟萃研究[8]表明，非亚洲地区、南亚地区和东亚地区的无乳链球菌定植率分别为：18%(95%CI:17%～19%)、12.5%(95%CI:10%～15%)和11%(95%CI:10%～12%)。虽然本研究中妊娠妇女无乳链球菌的定植率(9.6%)和其他东亚地区相近，但据报道[2, 9]不同地区的定植无乳链球菌的表型和基因型特征均存在差异，又考虑到我国地域广阔和庞大的人口基数，因此深入了解揭阳地区定植菌株的遗传多样性和耐药性等菌群结构特征，对该地区的无乳链球菌引起感染的防控仍至关重要。

MLST是细菌分型研究常用的方法，可快速揭示菌群的谱系分布特征[10]。MLST结果显示，本地区的定植无乳链球菌来源于8个CCs，但却可分为21个ST，这表明揭阳地区流行的定植菌株有较高的遗传多样性。本地区流行的CC主要是CC19、CC17和CC103(共占74.8%)，这不同其他国家的报道，如:加拿大主要流行的CC为CC1、CC23和CC19[11],埃塞俄比亚主要为CC8、CC2和CC23[12]，这说明主要CC的分布存在地理区域性差异。CC19(主要为ST19)在国内其他地区也是主要流行的CC[2, 13-14]；而CC17作为国内引起新生儿侵袭性感染中重要的CC主要南方地区流行[14-15]，这和本研究的结果相一致。国外报道的CC103菌株主要引起牛乳房炎而人类感染较为少见[16]。然而本研究中CC103(占16.6%)为主要的流行CC之一，其所占比例及主要ST组成与其他华南地区相一致，如：南宁[17]、广州[2]和深圳[14]。我们据此推测CC103已成为华南地区流行的主要定植无乳链球菌之一，且其主要ST构成相似。但鉴于以上研究多为单中心、小样本的研究，因此以上推测仍需要更多的流行病学数据支持。

无乳链球菌表面的荚膜多糖是其重要的毒力因子，也是血清学分型的重要依据[10]。因此，了解无乳链球菌的血清型，对了解其致病性至关重要。无乳链球菌血清型有10种，其中世界各地流行的定植菌株多为Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ等6种血清型(占98.0%以上)[8]。本研究共发现5种血清型(Ia、Ib、Ⅱ、Ⅲ和Ⅴ)，这表明本地区流行的定植菌株的血清型和世界各地相似。Ⅲ、Ia和Ib等3种类型(占86.4%)为本地区流行主要血清型，这和广州[2](93.0%)、东莞[18](85.7%)等地相似，但不同于其他地区，如：上海和多伦多均以Ⅲ、Ⅴ和Ia为主[11, 19]，而巴西[20]则以Ia、Ⅱ和Ib为主。此外，本研究表明，大部分ST与特定的血清型相对应，如：所有ST17均为Ⅲ型；所有ST103均为Ia；但部分ST的血清型分布存在多样性，如ST19菌株，这也表明了其遗传的多样性。值得注意的是，ST17/血清学Ⅲ型被认为是高毒力菌株[15]，可引起威胁生命的新生儿侵袭性感染，而本研究中ST17/血清学Ⅲ型高达18.4%(19/103)。

目前，对于定植无乳链球菌引起产后感染的防控，美国CDC指南[21]推荐采用青霉素作为首选药物进行分娩前的抗生素预防。本研究中，所有定植菌株对青霉素均敏感，可作为防御性治疗的首选药物。对于青霉素过敏者，红霉素和克林霉素是其作为分娩前抗生素预防的中药替代药物。然而，本研究中，定植菌株对红霉素和克林霉素的耐药率高(均>60.0%)，因此，若以红霉素或克林霉素作替代药物，需结合药敏试验的结果进行选择用药而不适用于经验性用药。定植无乳链球菌对红霉素和克林霉素的高耐药率，与北京[5]、广州[2]和福州[22]等国内其他地区报道一致。此外，本地区定植菌株对四环素的耐药率高达94.2%，在国内其他地区[23]同样存在。值得注意的是，本地区定植无乳链球菌的多重耐药率较高。本研究对不同血清型的耐药率进行比较，表明不同血清型对红霉素、克林霉素、左氧氟沙星、氯霉素的耐药率以及多重耐药率均存在差异(P均<0.05)。本研究中，对红霉素耐药的定植菌株主要是由ermB基因介导的cMLSB型，这与北京[5]和上海[19]地区的报道相似；但本地区的M型(占18.9%)高于北京地区(占5.2%)。据报道[24]，法国马塞地区以M型为主，而巴黎地区以iMLSB型为主。这些研究均表明，不同地区的红霉素耐药表型存在差异。而红霉素耐药不仅存在表型的差异，其基因型也有一定差异，如国外学者认为M型主要由mefA/E基因介导[24-25]，而在我国存在ermB基因独立介导M型的报道[5, 19]，本研究和国内的报道一致。此外，本研究有3株S型菌株检出mefA/E基因，这可能mefA/E基因不表达有关。红霉素耐药表型、基因型与ST相关研究表明，部分ST各菌株的耐药表型和基因型较为一致，但部分ST的耐药表型和基因型却表现出多样性。本研究中，克林霉素耐药株linB基因检出率仅为54.8%，这说明定植菌株对克林霉素耐药可能还与其他耐药机制有关。

总之，揭阳地区的定植无乳链球菌存在较高的遗传多样性，总体上其分子流行特征和耐药特点与其他地区相似，但也有其自身的特点：(1)CC103已成为该地区流行的主要CC之一；(2)ST17/血清学Ⅲ型为该地区流行的主要定植菌株之一；(3)该地区定植菌株对红霉素、克林霉素、四环素的耐药率以及多重耐药率较高；(4)红霉素耐药以ermB基因介导的cMLSB型，克林霉素耐药部分由linB基因介导。