AngⅡ及AT1R在膀胱肿瘤发生发展及浸润转移中的意义*

涂小峰, 李中军, 韩新军, 胡义

1郑州市第七人民医院急诊科(河南郑州 450016)； 2河南省人民医院泌尿外科(河南郑州 450003)

膀胱癌是泌尿外科常见的一类生殖系统恶性肿瘤，在男性中发病率较高，是女性的3～4倍，其患病率呈逐年增加趋势[1-2]。膀胱癌好发于为50～60岁人群，其发病率和进展复发率均较高，若未得到及时诊治，从出现症状到病死时间平均16个月[3-4]。预后控制不佳主要归因于尚未完全阐明膀胱癌的发病机制，膀胱癌细胞浸润深度、转移程度及分化程度对患者预后影响最大。因此，阐明膀胱癌发生、进展及浸润转移的分子机制，寻找有效的生物分子标志物用于早期诊治及预后评估将具有重要的临床意义。血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ, AngⅡ)是肾素-血管紧张素系统中活性小分子多肽，主要作用是调节心血管和肾脏稳态及水、电解质代谢平衡，AngⅡ主要是通过血管紧张素Ⅱ 1型受体(angiotensin Ⅱ 1 receptor,AT1R)来发挥生理调节作用这些细胞效应的[5]。近年研究发现,AngⅡ及AT1R参与肝癌、胃癌等多种癌症组织表达上调[6]，肿瘤血管生成是肿瘤发生、发展、浸润和转移过程中的关键环节，而研究发现AngⅡ及AT1R与肿瘤的血管生成、增殖和转移紧密相关，AngⅡ及AT1R的表达增加，意味着临床分期晚和浸润更深，预后不佳[7-9]。但它们表达及失衡情况与膀胱癌发展、浸润转移的关系尚未见报道。本研究免疫组化SP法和荧光定量RT-PCR检测60例膀胱癌患者AngⅡ及AT1R表达情况，探讨其与膀胱癌发生、发展及浸润转移的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2017年6 月至2019年12月郑州市第七人民医院收治的术后膀胱癌组织及其癌旁正常膀胱癌组织60例，其中男35例，女25 例，年龄30～70岁，平均(53.46±5.65) 岁，根据TNM分期标准进行临床分期: 其中Ⅰ期15例，Ⅱ期21例，Ⅲ期14 例，Ⅳ期10例，肿瘤最大径1～5 cm，平均(3.63±0.56)cm。纳入标准：(1)经术后病理组织确诊为膀胱癌[10]；(2)术前未接受任何放化疗治疗；(3)无精神认知功能障碍，可进行良好沟通；(4)患者或其家属签署知情同意书。排除标准: (1)合并有心、肝、肾严重功能不全患者；(2)妊娠及哺乳期妇女；(3)不同意参加研究者。研究已经郑州市第七人民医院伦理委员会审批(批号：L2017011)，所有患者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 免疫组织化检测AngⅡ及AT1R蛋白表达 多聚甲醛固定标本，石蜡包埋，进行连续切片，约4 μm厚，经常规脱蜡，抗原修复，使用3%的过氧化氢避光孵育30 min抑制内源性氧化酶，用山羊血清封闭，加入一抗工作液(AngⅡ和AT1R兔抗人多克隆抗体，稀释比均为1∶150)，4℃孵育过夜，生物素标记的二抗37℃孵育60 min，采用DAB显色苏木素复染3 min，常规脱水，中性树胶封片，采用已知表达性的切片作为阳性对照，使用PBS 缓冲液代替一抗性作为阴性对照。

1.2.2 荧光定量RT-PCR检测AngⅡ及AT1R mRNA表达 二甲苯脱蜡，无水乙醇洗去残留二甲苯，室温干燥，加入组织裂解液和蛋白酶K于55℃金属浴孵育器2 h；根据Trizol法提取组织总RNA。用紫外分光光度计测定RNA浓度，并计算总RNA的A260/A280，比值在1.6～2.0范围即为纯度合格，取1 μg RNA进行逆转录合成cDNA，严格根据TAKARA公司的逆转录试剂盒和荧光定量PCR试剂盒说明步骤进行逆转录反应和PCR反应。以β-actin为内参照，去离子水作为阴性对照。引物由上海生工生物技术有限公司合成，序列见下表，反应程序为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环；最后于72℃ 5 min，采用2-ΔΔCt表示表达量。

表1 引物序列

1.3 指标观察和标准 AngⅡ及AT1R 均着色在细胞的胞质和胞膜上，AngⅡ染色为浅黄色、棕黄色或深棕色。AT1R染色为浅黄色、棕黄色或棕褐色，所有切片均随机取5个视野在400倍高倍镜下观察，根据阳性细胞着色程度及阳性细胞百分比进行评分。着色程度评分：未着色为0分，淡黄色为1 分，棕黄色为2分，深棕色或棕褐色为3分。阳性细胞百分比评分：无阳性细胞为0 分，阳性细胞百分比<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，76%～100%为4分。着色程度+阳性细胞百分比评分为总分，10分以下分为阴性，10分及以上为阳性[11]。

2 结果

2.1 AngⅡ及AT1R蛋白在癌组织及旁癌组织中的表达情况 膀胱癌组织AngⅡ及AT1R蛋白表达明显高于癌旁正常膀胱癌组织，差异有统计学意义(P<0. 05)，见表2、图1。

表2 AngⅡ及AT1R蛋白在癌组织及旁癌组织中表达情况 例(%)

注：A：AngⅡ在膀胱癌组织中表达，B：AngⅡ在膀胱癌旁组织中表达，C：AT1R在膀胱癌组织中表达，D：AT1R在膀胱癌旁组织中表达

2.2 AngⅡ和AT1R mRNA在癌组织及旁癌组织中的表达 膀胱癌组织AngⅡ的 mRNA相对表达量为1.89±0.51，癌旁组织的为1.06±0.25，膀胱癌组织AT1R mRNA相对表达量为1.95±0.53，癌旁组织的1.04±0.21，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.3 AngⅡ蛋白及mRNA与膀胱癌患者临床病理特征的关系 AngⅡ蛋白及mRNA在膀胱癌组织中的表达均与肿瘤的分化程度、临床分期、浸润和淋巴结转移有关(P<0.05)，而与患者性别、年龄及肿瘤大小无关(P>0.05)，见表3。

2.4 AT1R蛋白及mRNA与膀胱癌患者临床病理特征的关系 AT1R蛋白及mRNA在膀胱癌组织中的表达均与肿瘤的分化程度、临床分期、浸润、淋巴结转移和远处转移有关，而与患者性别、年龄及肿瘤大小无关，见表4。

2.5 AngⅡ和AT1的影响因素logistic回归分析 以性别(男=0，女=1)、年龄(≥50岁=1，<50岁=2)、肿瘤直径大小(≤3 cm=0，>3 cm=1)、分化程度(低分化=1，中分化=2，高分化=3)、浸润深度(浅表浸润=1，肌层浸润=2)、TNM分期(Ⅰ期=1，Ⅱ期=2，Ⅲ期=3，Ⅳ期=4)、淋巴结是否转移(无=0，有=1)为自变量，以AngⅡ及AT1R为因变量，多因素logistic回归分析结果显示，膀胱癌患者的分化程度、浸润深度、肿瘤分期及淋巴结转移会明显影响AngⅡ及AT1R的表达，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表5～6。

表3 AngⅡ蛋白及mRNA与膀胱癌患者临床病理特征的关系

表4 AT1R蛋白及mRNA与膀胱癌患者临床病理特征的关系

表5 AngⅡ的影响因素logistic回归分析

表6 AT1R的影响因素logistic回归分析

3 讨论

膀胱癌是最常见的泌尿系统肿瘤，主要来源于膀胱上皮组织和间质组织。膀胱癌根据组织学类型可分为移行细胞癌、鳞状细胞癌、腺癌及混合型[12]。其中移行细胞癌占绝大部分，根据浸润程度，浅表性约占70%，20%为浸润性[13-14]，目前临床上治疗膀胱癌采用手术治疗为主的综合治疗，但预后较差，主要原因是确诊时大多已发生转移并且膀胱癌复发率高[15],因此实现早期诊断膀胱癌对于改善预后具有重要意义，然而目前的技术手段仍有一定难度。从目前研究来看，细胞浸润深度和转移对预后影响颇大，从分子和基因层面来看，膀胱癌的浸润和转移具有明显的遗传特征，但膀胱癌转移的分子机制尚未完全阐明。故探讨膀胱癌进展及浸润转移的分子机制，有效评估膀胱癌转移及预后对于延长患者生存期和改善预后具有重要的意义。

以往研究AngⅡ和AT1R的功能主要集中于调节心血管功能，如参与调节血管的收缩、细胞增殖、迁移、凋亡和分化，以及形成细胞外基质和炎症。近年来AngⅡ和AT1R在肿瘤中的作用受到国内外学者的关注[16]。但其在膀胱癌进展和浸润转移中的作用却鲜见报道，对此，本研究采用免疫组化SP法和荧光定量PCR检测PTC 组织及癌旁正常膀胱癌组织的AngⅡ和AT1R蛋白和mRNA表达情况，结果发现膀胱癌组织的AngⅡ和AT1R 蛋白和mRNA明显高于癌旁正常组织，提示AngⅡ和AT1R与膀胱癌的进展密切相关。通过分析AngⅡ和AT1R与临床病理特征相关性发现，AngⅡ及其AT1R与分化程度、临床分期、浸润和淋巴结转移有关，意味着临床分期越晚，组织分化越差，浸润程度更深和淋巴结转移越严重，则表达水平越高,表明AngⅡ及其AT1R是浸润转移的重要分子标志。膀胱肿瘤的发生、发展及浸润转移属于多因素参与的病理生物学过程。侵袭转移包括肿瘤细胞在机体内的一些列过程，包括肿瘤细胞的运动、黏附、迁移、生长、新血管生成、逃避免疫等多种行为。据以往研究显示在肿瘤组织中，AngⅡ主要通过AT1R结合通过激活促使了肿瘤的生长以及转移，而可以促进肿瘤的生长以及肿瘤血管的生成，AT1R可促进细胞增殖激活表皮生长因子受体，激活ERK1/2级联效应，并持续激活细胞信号转导因子，进而调节靶基因转录表达，包括编码抗凋亡蛋白Bcl-2和增殖相关蛋白cyclin D1和myc，以及促血管发生因子VEGF，促使细胞的异常增殖并阻断其凋亡[17-20]。Dolley-Hitze等[21]通过免疫组织化学法、蛋白质印迹法和实时定量聚合酶链反应法检测发现，AT1R在肾透明细胞癌中的表达明显高于在正常组织中的表达。Shirotake等[22]对检测膀胱肿瘤组织AT1受体，发现在肌层浸润膀胱癌组织AT1受体阳性表达率为76%，明显高于非肌层浸润组织的43%。Arrieta等[23]发现AT1受体阳性表达强度与星形胶质瘤肿瘤恶性分级、细胞增殖、血管增生明显相关。进一步的，多因素分析显示膀胱癌患者的分化程度、浸润深度、肿瘤分期和淋巴结转移会明显影响AngⅡ及AT1R的表达，进一步证实了AngⅡ及AT1R的表达与膀胱癌患者浸润转移的关系。本研究结果提示AngⅡ及AT1R的表达上调与膀胱肿瘤的发生发展、浸润转移密切相关，高表达的AngⅡ及AT1R提示膀胱肿瘤细胞更具有明显的侵袭性。因此，可通过检测膀胱肿瘤组织AngⅡ及AT1R表达评估膀胱肿瘤的发生发展和浸润转移程度，以及膀胱癌的预后，可通过给予针对性的治疗延缓膀胱癌的发生、发展和浸润转移。

综上所述，AngⅡ及AT1R mRNA在膀胱癌组织中表达上调，其表达量与膀胱癌的分化程度密切相关。提示AngⅡ及AT1R有望成为膀胱癌侵袭转移的预测指标，且可望成膀胱癌靶向治疗的有效靶点。