大鼠脊髓撞击损伤模型的建立和鉴定

林 翔，刘蔚楠，林家钟，王荣茂

（福建中医药大学附属人民医院，福建福州350004）

脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）是常见的严 重的中枢神经损伤性疾病，常致患者截瘫，严重影响患者身心健康，给家庭和社会带来沉重负担。稳定、可靠的脊髓损伤模型是研究脊髓损伤机制及治疗方法的前提，本研究旨在Allen′s法造模原理基础上设计出一种经济、操作简单、稳定性高、临床相似度好、易于推广的脊髓撞击损伤模型，为脊髓损伤研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 成年健康清洁级SD大鼠，雌雄不限，体质量300 g左右，由上海斯莱克实验动物有限公司提供［许可证号：SCXK（沪）2007-0005］。

1.1.2 仪器与试剂 生物显微镜（Olympus，Japan），体式显微镜（Olympus，Japan），数码相机（Olympus，Japan），肌电图－诱发电位记录仪（Nicolet-Viking膝上型），自制脊髓损伤打击器（图1，主要由套管及30 g克氏针组成），10%水合氯醛，4%多聚甲醛，0.5%伊红液，苏木素染色液，80%乙醇，90%乙醇，95%乙醇，无水乙醇，二甲苯。

1.2 实验方法

脊髓撞击损伤模型建立：SD大鼠32只，按随机数字法随机分为A、B、C、D 4组，每组8只。以10%水合氯醛腹腔注射，麻醉后将大鼠俯卧位固定于手术台板上，背部剃毛，常规消毒铺巾。以与最低位肋骨相连的椎骨（T12）作为定位标志，以T10棘突为中心作长约3 cm的后正中切口，暴露T9-11棘突及椎板，切除T10椎板，充分暴露脊髓T10段。将1 mm厚小垫片贴附在硬脊膜上，用30 g克氏针沿套管从不同高度自由坠落（A组坠落高度为1.5 cm，B组坠落高度为2.0 cm，C组坠落高度为2.5 cm，D组坠落高度为3.0 cm，撞击冲量=质量×高度），垂直打击直接造成脊髓损伤，撞击脊髓后克氏针在脊髓表面停留5 s。如局部脊髓迅速水肿、瘀血，大鼠全身迅速回缩样抖动，提示撞击模型成功。关闭切口，大鼠单笼饲养，用青霉素4×104U/d抗感染，连用3 d。

1.3 检测指标

1.3.1 组织学观察 术后14 d所有实验大鼠采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉后，沿胸骨柄剪开胸腔，暴露心脏，将灌注针头插入主动脉，快速用生理盐水冲洗血液后，再用4%多聚甲醛灌流固定1.5 h。以损伤区域为中心切取约1 cm长的脊髓组织，用4%多聚甲醛溶液浸泡固定2 h后常规石蜡包埋，连续横向切片，行HE染色显微镜下观察脊髓损伤区域结构。

1.3.2 行为学观察 各组大鼠在造模前1 d，造模后1 d、3 d、7 d、14 d按Tarlov评分标准行神经功能评定。以0～2分为截瘫，采用双人双盲独立评分后取平均值。

1.3.3 神经电生理检测 体感诱发电位（SEP）：刺激电极置于大鼠正中神经和胫后神经处，参考电极插入额部皮下，记录电极插入两耳连线中点［1-2］。刺激参数：强度2.0 mA、时程20 ms、频率3.43 Hz、叠加次数300次。记录各组大鼠损伤前、损伤后1 d、3 d、7 d及14 d体感诱发电位潜伏期及波幅的变化。运动诱发电位（MEP）：刺激电极置于大鼠颅顶冠状缝前2 mm，矢状缝旁2 mm皮下，记录电极插入肱三头肌和腓肠肌腹中部［1-2］。强度30 V，串数5个。记录各组大鼠损伤前、损伤后1 d、3 d、7 d及14 d运动诱发电位潜伏期及波幅的变化。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0进行数据统计。计量资料符合正态分布的以均数±标准差（±s）表示，组间采用单因素方差分析，组内比较采用t检验。P〈0.05为差异有统计学意义。

图1 简易打击器的制作和应用

2 结果

2.1 大鼠脊髓撞击损伤组织HE染色

A组：神经元细胞呈三角形，尼氏体分散在胞质中，胶质细胞轮廓清楚，神经纤维排列整齐、紧密。B组：神经元细胞减少，但轮廓仍清楚，神经纤维排列稀疏，结构尚清。C组：神经元细胞稀少，轮廓欠清，可见空泡样变性，神经纤维排列欠清。D组：神经元细胞更稀少，轮廓欠清，空泡样变性增多，神经纤维排列不清。结果见图2。

图2 脊髓组织HE染色（×100）

2.2 大鼠脊髓撞击损伤Tarlov评分

A组大鼠Tarlov评分在造模后1 d、3 d较造模前1 d降低，差异有统计学意义（P〈0.05），造模后7 d、14 d与造模前1 d比较差异无统计学意义（P〉0.05）；B组大鼠Tarlov评分在造模后1 d、3 d、7 d较造模前1 d降低，差异有统计学意义（P〈0.05），造模后14 d与造模前1 d比较差异无统计学意义（P〉0.05）；C组及D组大鼠Tarlov评分在造模后1 d、3 d、7 d、14 d均较造模前1 d降低，差异有统计学意义（P〈0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠不同观测点Tarlov评分比较 ，±s（分 ）

表1 各组大鼠不同观测点Tarlov评分比较 ，±s（分 ）

注：与本组造模前1 d比较，1）P〈0.05

?

2.3 各组大鼠不同观测点截瘫例数比较

A组及B组造模后1 d分别有4只及7只大鼠截瘫，造模后7 d无大鼠截瘫；C组造模后1 d所有大鼠截瘫，造模后14 d仍有5只大鼠截瘫（P〈0.05）；D组造模后1 d大鼠均截瘫，造模后14 d仍截瘫。结果见表2。

表2 各组大鼠不同观测点截瘫例数比较 （例）

2.4 大鼠脊髓撞击损伤神经电生理检测

造模后电生理检测中SEP、MEP潜伏期和波幅较造模前均有不同程度的改变，按A组至D组改变程度依次加大（P〈0.05）。A组大鼠在造模后14 d SEP、MEP潜伏期和波幅恢复至造模前水平；B组和C组造模后14 d SEP、MEP潜伏期和波幅均不能恢复至造模前水平（P〈0.05），且C组较B组恢复差（P〈0.05）。D组大鼠造模后各观察点SEP、MEP潜伏期和波幅数值均为0。结果见表3～表6。

表3 各组大鼠不同观测点SEP潜伏期测量结果比较（m s，±s）

表3 各组大鼠不同观测点SEP潜伏期测量结果比较（m s，±s）

注：与本组造模前1 d比较，1）P〈0.05；与B组同一时间比较，2）P〈0.05

?

表4 各组大鼠不同观测点SEP波幅测量结果比较 （m V，±s）

表4 各组大鼠不同观测点SEP波幅测量结果比较 （m V，±s）

注：与本组造模前1 d比较，1）P〈0.05；与B组同一时间比较，2）P〈0.05

?

表5 各组大鼠不同观测点MEP潜伏期测量结果比较 （m s，±s）

表5 各组大鼠不同观测点MEP潜伏期测量结果比较 （m s，±s）

注：与本组造模前1 d比较，1）P〈0.05；与B组同一时间比较，2）P〈0.05

?

表6 各组大鼠不同观测点MEP波幅测量结果比较 （m V，±s）

表6 各组大鼠不同观测点MEP波幅测量结果比较 （m V，±s）

注：与本组造模前1 d比较，1）P〈0.05；与B组同一时间比较，2）P〈0.05

?

3 讨论

Allen AR在1911年创造了通过垂直打击脊髓制备脊髓损伤模型的方法。该法以一定力量撞击脊髓后造成脊髓缺血、水肿及继发的一系列反应，比较接近人类脊髓损伤的病理、生理及变化规律，临床相关性好［3-6］。由于根据Allen′s法原理研制出的标准打击器价格昂贵，在国内未能普及。本实验基于经典Allen′s法原理制作简易打击器，并对使用该打击器所制作的大鼠脊髓损伤模型进行评价。

简易打击器的制作及使用方法：1 mL医用注射器的内径为4.0 mm，将注射器头端剪开制作成一个套管，在套管外侧粘医用胶布并标记刻度，起始刻度位于注射器尾端。测量直径4.0 mm克氏针的总质量和总长度，截取质量为30 g的克氏针作为撞针。暴露好脊髓后将1 mm厚小垫片贴附在硬脊膜上，注射器套管的尾端垂直放在小垫片上（注射器尾端的翼有利于垂直放置套管）。克氏针顺着套管从不同高度垂直打击脊髓，从而完成脊髓打击损伤模型的制作。

国内文献报道大鼠脊髓打击损伤模型研究中的打击冲量多集中在20～100 g/cm［7-8］。因大鼠脊髓轻度损伤时具有较强的自愈性［9-10］，不利于观察实验干预情况，故本研究选取的打击冲量为45～90 g/cm。本研究大鼠脊髓HE染色显示随着打击冲量增加，组织学损伤程度加重：A组大鼠脊髓神经元细胞未见明显减少、皱缩，神经纤维排列整齐；B组大鼠脊髓神经元细胞减少，神经纤维排列稀疏。C组大鼠脊髓神经元细胞稀少，可见空泡样变性，神经纤维排列欠清。D组大鼠脊髓神经元细胞较C组更稀少，轮廓欠清，空泡增多，神经纤维排列不清。本实验各组大鼠脊髓打击损伤后均出现Tarlov评分下降，A组及B组大鼠造模后不能达到100%的截瘫率，造模后Tarlov评分逐渐恢复，造模后7 d接近术前水平。C组大鼠造模后截瘫率为100%，造模后Tarlov评分逐渐恢复，但造模后14 d仍恢复不到术前水平。D组大鼠脊髓打击损伤后造成所有大鼠完全性瘫痪，造模后14 d仍无恢复。造模后除D组外电生理检测中SEP、MEP潜伏期和波幅较造模前均有不同程度的改变，按A组至C组改变程度依次加大，A组大鼠在造模后14 d SEP、MEP潜伏期和波幅恢复至造模前水平；B组和C组造模后14 d SEP、MEP潜伏期和波幅不能恢复至造模前水平，且C组较B组恢复差。D组大鼠造模后各观测点SEP、MEP潜伏期和波幅均无反应。

结果发现A组和B组能够造成部分大鼠截瘫，但在无治疗干预情况下大鼠脊髓损伤可较好恢复，所以不利于观察各种治疗方法对大鼠脊髓损伤的干预效果；D组能够造成所有大鼠截瘫，但造模后各观测点大鼠脊髓损伤无任何恢复迹象，脊髓损伤可能为不可逆损伤，故各种治疗方法的干预可能对该组大鼠脊髓损伤恢复无效或者疗效不显著，不利于实验观察；C组采用75 g/cm打击冲量造模能够造成所有大鼠截瘫，且造模后大鼠脊髓损伤有一定程度恢复，具有可逆性，更有利于观察各种治疗方法对大鼠脊髓损伤恢复的干预效果，故我们认为采用该方法制作大鼠脊髓损伤模型的打击冲量选75 g/cm较为合适。

本研究采用简易打击器制作大鼠脊髓损伤模型（打击冲量为75 g/cm）可造成所有大鼠截瘫，模型可重复性高。其脊髓病理学表现、神经行为学评分及神经电生理检测表明这种脊髓损伤具有可逆性，可作为理想的脊髓打击伤治疗研究的动物模型。