基于GC-MS的九香虫脂肪油入血成分分析

路晓娟，郎 霞，李会芳

（山西中医药大学，山西 晋中030619）

九香虫为蝽科昆虫九香虫（Aspongopuschinensis Dallas）的干燥体，具有理气止痛、温中助阳的功效，用于胃寒胀痛、肝胃气痛、肾虚阳痿、腰膝酸痛等，具有较高的药用和营养价值。现代药理学研究表明九香虫具有抗肿瘤和改善生殖损伤的作用，另外还有抗菌、抗氧化、抗凝血、抗溃疡、抗疲劳等多种药理活性［1-7］。前期课题组研究证实九香虫脂肪油对两种动物胃溃疡模型（应激型、无水乙醇诱发型）都具有良好的胃黏膜保护作用［7］，九香虫脂肪油为其抗消化性溃疡的有效部位，但其体内物质基础尚不明确，限制了其进一步开发利用及临床合理用药。本次实验采用GC-MS检测九香虫脂肪油给药后的主要入血成分，为揭示九香虫脂肪油发挥药效的物质基础提供依据［8］。

1 实验与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 HGC-12A氮吹仪（天津市恒奥科技发展有限公司）、PA224型电子精密天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）、TGL-18型台式高速冷冻离心机（四川蜀科仪器有限公司）、PL-S40型康士洁牌数码超声仪、气相色谱－质谱联用仪（美国Finnigan公司生产）。

1.1.2 试剂与材料 九香虫脂肪油由本实验室采取超临界流体萃取工艺自制［9］，市售欧丽薇兰橄榄油，甲醇、正己烷为色谱纯（购自天津益仁达化工有限公司）。

1.2 实验动物

清洁级健康SD大鼠12只，雌雄各半，体重为180～220 g，购自山西医科大学实验动物中心，动物合格证号为SCXK（晋）2015-0001。

1.3 方法

1.3.1 给药与取血 取SD大鼠12只，雌雄各半，随机分成空白组和九香虫脂肪油组，适应性喂养1周。禁食12 h（自由饮水）后，每天按照2.1 g/kg剂量灌胃给予九香虫脂肪油（用橄榄油溶解至所需浓度），连续灌胃4 d，空白组给与等体积的橄榄油。末次灌胃1 h后，用水合氯醛麻醉大鼠，开腹后用一次性取血针腹主动脉取血于肝素抗凝采血管中，取血量为5 mL左右。取血后轻轻摇动采血管防止凝血，室温放置30 min后，离心15 min（3000 r/min），取上清液血浆。将处理好的血浆做好标记，冷冻保存。将同组血浆混合，消除个体差异。

1.3.2 血浆处理与分析 空白血浆：取空白组血浆200μL于离心管中，处理方法如下，加入10%H2SO4-CH3OH溶液2 mL，混悬1 min，62℃水浴2 h。冷却后加入一定量的无水硫酸钠及2 mL的正己烷，混悬1 min。常温离心5 min（3500 r/min），取上清液于1.5 mL的EP管中，氮气吹干。含药血浆：取九香虫脂肪油组血浆200μL于离心管中，处理方法同空白血浆。九香虫脂肪油：取200μL九香虫脂肪油于离心管中，处理方法同空白血浆。

1.3.3 气相色谱条件与质谱条件

1.3.3.1 GC条件 色谱柱JWDB-WAX23（30 m×0.25 mm×0.25μm），载气为氦气（99.999%），分流比10∶1，气化温度230℃。升温程序：初始温度50℃保留2min，以10℃/min升温至200℃，保留10min；以10℃/min升温至220℃，保留15 min。进样口温度200℃，2.2项下样品加入100μL正己烷复溶，离心，取上清液1μL进样GC-MS分析。

1.3.3.2 MS条件 离子源温度：230℃，电离方式：标准EI源，电子能量：70 eV，质量范围（m/z）：30～450 m/z，延迟时间：5 min，扫描间隔：0.58 s，数据分析采用NIST质谱计算机数据系统。

2 结果

2.1 各样品离子流图及分析结果

按上述气相色谱条件和质谱条件进样分析，对总离子流图中的各峰经质谱扫描后得到质谱图，经NIST质谱计算机数据系统检索和人工谱图分析确认各化合物［10-13］，总离子流图如图1、图2、图3。通过对比含药血浆离子流图和脂肪油离子流图指认5个入血原型成分［3，5-二（1，1-二甲基乙基）苯酚、软脂酸甲酯、油酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯］和3个可能为九香虫脂肪油的体内代谢物，即烯丙基草酸壬酯、（11，14）-二十碳二烯酸甲酯、四环素［7.1.0（1，6）·0（4，9）·0（8，10）］癸烷，这些入血成分可能为九香虫发挥药效的物质基础。通过空白血浆和含药血浆共有成分比对，发现软脂酸和14-甲基十五烷酸也是血浆中的固有物质即内源性成分（见表1）。

图1 空白血浆离子流图

图2 含药血浆离子流图

表1 GC-MS鉴定的九香虫脂肪油入血成分及代谢产物

图3 九香虫脂肪油离子流图

3 讨论

本研究通过对比含药血浆离子流图和脂肪油离子流图指认了5个入血原型成分［3，5-二（1，1-二甲基乙基）苯酚、软脂酸甲酯、油酸甲酯、14-甲基十五烷酸甲酯、乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯］和3个可能为九香虫脂肪油体内代谢物，即烯丙基草酸壬酯、（11，14）-二十碳二烯酸甲酯、四环素［7.1.0（1，6）·0（4，9）·0（8，10）］癸烷，这些入血成分可能为九香虫发挥药效的物质基础。

九香虫中的脂肪酸主要含有油酸、亚油酸、软脂油酸、软脂酸、硬脂酸、亚麻酸、豆蔻酸、十四碳一烯酸、花生酸、二十二酸、芥酸、二十二碳二烯酸、二十四酸等［2，10-13］。涂爱国等［11］研究认为含量排序依次为油酸（44.17%）、亚油酸（21.48%）、软脂酸（20.28%）；李俐等［12］认为含量以油酸（49.48%）和软脂酸（41.54%）为主；刘伦沛等［14］测得含量较多的为软脂油酸（24.14%）、软脂酸（24.03%）和油酸（20.41%）；课题组前期超临界萃取的脂肪油中主要含有油酸（33.75%）、软脂酸（8.38%）、亚油酸（19.91%）［9］。

本研究表明在5个入血原型成分中，在原药材中含量较高的软脂酸甲酯、油酸甲酯也有检出，与文献中提到脂肪酸的主要成分一致，其中软脂酸同时也为血液中内源性成分。目前认为游离脂肪酸中的软脂酸通过下调Bcl-2，抑制抗凋亡能力，从而促进细胞凋亡，使内皮祖细胞增殖能力下降［15］；并能够诱导胰岛β细胞凋亡［16］。而游离脂肪酸中的油酸可参与糖脂代谢，改善外周组织对葡萄糖的摄取，诱导胰岛素的产生和分泌，并抑制肿瘤坏死因子α（TNF-α）的活性，而TNF-α可引起外周组织胰岛素抵抗，抑制胰岛素分泌；除调节机体代谢外，油酸在人体还发挥着保护心血管、抗炎、抗肿瘤、调节免疫、改善氧化应激等多种重要功能［17］。推测九香虫脂肪油抗溃疡作用与油酸的上述药理作用有关，但油酸与消化性溃疡的直接关系有待进一步深入研究。

本研究确认的5个入血原型成分中，乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯结构类似物（3Z，13Z）-3，13-octadecadien-1-ol被发现具有生物性信息素作用［18］，是东北亚地区常见的一种扁桃害虫-双叶李雌性吸引雄性的关键，而14-甲基十五烷酸甲酯、乙酸（6Z，13Z）-十八碳烯酯的生物活性尚不明确，其他代谢产物烯丙基草酸壬酯、（11，14）-二十碳二烯酸甲酯、四环素［7.1.0（1，6）·0（4，9）·0（8，10）］癸烷的生物活性及代谢途径也尚不明确。

研究表明多种植物油脂和动物油脂具有较好的抗实验性胃溃疡作用［7，19-20］，但由于脂肪酸中物质组成复杂、内源性成分干扰等问题，对其体内物质基础的研究尚属空白，有待进一步深入研究。另外如何趋利避害，分离提取油脂中有益健康的成分进行中成药的研究，应成为进一步研究的重点。