中长链甘油三酯对大鼠肝脏脂质代谢的调节作用

杜映雪，李 静，陈孙妮，李 娟，邓泽元

肥胖作为全球性的健康问题，其发生会增加糖尿病、高血压和冠心病等疾病的发病率[1]。运动不足、饮食结构不合理、激素分泌异常、遗传等许多因素可导致肥胖，而高脂饮食伴随的过量卡路里摄入是导致肥胖发生的首要因素。治疗肥胖的首选为调整饮食结构，控制饮食中的脂肪总量[2]。然而，脂肪为机体提供必需脂肪酸、脂溶性维生素和能量，过分降低膳食中脂肪量不可取。寻找符合营养需求同时具有减重功效的产品，对于改善机体脂代谢，预防一系列并发症尤其是心血管疾病的发生以及促进人类健康具有重大意义。为此，可从膳食脂肪的结构出发，寻找膳食脂肪的替代品。中长链甘油三酯（medium and long-chain triacylglycerols，MLCT）是一种由天然油脂通过改性或结构重组得到的结构脂质（structured lipid，SL），其在一个甘油三酯分子上同时结合有中链脂肪酸（medium chain fatty acid，MCFA） 和长链脂肪酸（long chain fatty acid，LCFA）[3]。研究表明，MCFA与LCFA 的生理代谢途径有着明显差异：MCFA有较短的碳链，在体内吸收代谢速率快，可直接通过门静脉进入肝脏氧化供能；而LCFA 的碳链较长，在体内代谢效率低，极易形成新的甘油三酯并贮藏在脂肪或肝脏等组织中[4]。国内外研究发现，MLCT 能加快脂质在体内的代谢速率，降低血脂、弱化脂蛋白代谢，减少脂肪蓄积[5-7]；可快速为机体供能[8]，有助于提高免疫力，降低炎症反应，预防2型糖尿病以及降低癌症发生风险[9-10]。MLCT 既保留了天然油脂的营养价值，又在其基础上降低油脂的热量，在食品和医药方面都有着广泛应用[11]。MLCT 有可能代替传统食用油脂，成为一种理想的功能型食用油。MLCT 对于机体的减脂作用已有研究，而MLCT 是否对于肝脏的脂质代谢有快速且明显的改善作用，国内鲜有报道。本试验以SD 大鼠为研究对象，对其给予由高油酸菜籽油（high oleic rapeseed oil，HORO）和中链甘油三酯（medium-chain triacylglycerols，MCT）通过酯交换反应合成的中长链甘油三酯，并通过与HORO 和MCT 的对比，探究短期内含有MLCT 的饮食对于动物肝脏脂肪酸组成和脂质代谢的影响，从而验证MLCT 对脂质代谢改善和肥胖预防的功效。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

SPF 级雄性SD 大鼠，初始体重为（100±10）g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供（SCXK（湘）2016-0002）。

中长链甘油三酯（MLCT）通过实验室方法[12]合成，所得产品油中MLCT 含量为71.1%；高油酸菜籽油（HORO），秦皇岛金海特种食用油工业有限公司；中链甘油三酯油（MCT），DUBOIS-NATURAL ESTERS SDN.BHD.公司；3 种油脂的脂肪酸组成见表1。总蛋白定量测定试剂盒、甘油三酯（TG）测定试剂盒、总胆固醇（TC）测定试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipoproteincholesterol，HDL-C）测定试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipoprotein-cholesterd，LDLC）测定试剂盒、载脂蛋白A1（apolipoprotein A1，Apo A1）测试盒、载脂蛋白B（apolipoprotein B，Apo B）测试盒、激素敏感脂肪酶（HSL）试剂盒、环磷酸腺苷（cAMP）测试盒、蛋白激酶A（PKA）试剂盒、脂肪甘油三酯脂酶（ATGL）试剂盒，南京建成生物工程研究所；普通大鼠全价混合饲料，南昌大学动物科学部；GLC-463 脂肪酸甲酯标准品，美国NU-CHEK-PREP 公司；正己烷（色谱纯），德国Meker 公司；其余试剂均为国产分析纯。

表1 3 种脂质的脂肪酸组成Table 1 Fatty acid compositions of the three lipids

MK3 型多功能酶标仪，芬兰Thermo 公司；6890N 型气相色谱仪，美国Agilent 公司；AR1140电子分析天平，美国奥豪斯贸易公司；HH-S11 型电热恒温水浴锅，北京医用离心机厂；TDL-40B 型台式离心机，上海安亭科学仪器厂；WH-866 涡旋混合器，太仓市科教器材厂；DSY-III 氮吹仪，北京金科精华苑科技有限公司；LGR-10 型冷冻离心机，郑州博科仪器有限公司；F6/10 超细匀浆机，广州深华公司，CNWBOND NH2氨基SPE 小柱，上海安谱实验科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 动物饲喂及分组 32 只雄性SD 大鼠饲养于南昌大学实验动物科学中心标准动物房。大鼠饲养温度控制在25 ℃左右，光照、黑暗时间为12 h，环境湿度为60%，所有实验大鼠均自由摄食基础饲料和水。基础饲料的营养组成见表2。适应性喂养1 周后，称量大鼠空腹体重，并随机分成4组，每组8 只：1）空白对照组（Control 组）：每日以1 g/100 g 体重的剂量灌胃生理盐水；2） 中长链甘油三酯组（MLCT 组）：每日以1 g/100 g 体重的剂量灌胃MLCT；3）中链甘油三酯组（MCT 组）：每日以1 g/100 g 体重的剂量灌胃MCT；4）高油酸菜籽油组（HORO 组）：每日以1 g/100 g 体重的剂量灌胃HORO。所有大鼠的喂养时间为2 周。

表2 基础饲料的营养组成Table 2 Nutritional compositions of the basic diet

1.2.2 样本处理 喂养结束后，禁食12 h，称量各组大鼠体重；乙醚麻醉，眼眶采血于含EDTA 的抗凝管中，室温下静止30 min，2 500 r/min 离心10 min，收集上层透明液体即为血浆，-80 ℃保存以备用。大鼠解剖后，取肝脏组织，用生理盐水清洗后称重，保存于-80 ℃备用。

1.2.3 血浆中指标的测定 按照试剂盒说明书方法测定血浆中TG、TC、HDL-C、LDL-C 含量，并计算HDL-C/LDL-C 比值。

1.2.4 肝脏中脂代谢指标的测定 称取大鼠肝脏，按质量（g）∶体积（mL）=1∶9 的比例加入生理盐水，冰水浴条件下机械匀浆1 min，2 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒说明书测定TG、TC、总蛋白含量；按照ELISA 试剂盒测定方法测定大鼠肝脏中Apo A1、Apo B 的浓度以及脂质代谢相关酶ATGL、HSL、PKA、cAMP 的表达水平。

1.2.5 肝脏中甘油三酯、磷脂脂肪酸组成的测定首先对肝脏内的总脂肪采用Folch 法进行提取[13]，后用丙基硅胶固相萃取小柱分离出总脂肪中的TG、PL，方法如下：取2 mg 脂质样品，将其溶解于0.5 mL 氯仿溶液中。以6 mL 正己烷溶液活化固相萃取小柱，加入样品，首先以4 mL 氯仿-异丙醇（2∶1，V/V）溶液洗脱，收集洗脱液为中性脂质，再以4 mL 乙酸-乙醚（2∶98，V/V）溶液洗脱，除去游离脂肪酸，最后以4 mL 甲醇溶液洗脱，收集洗脱液为磷脂，氮气吹干。中性脂质用氮气吹干后，加入0.2 mL 正己烷溶液溶解，另取一根固相萃取小柱，以正己烷溶液活化后，首先以正己烷溶液洗脱，除去胆固醇酯，再以6 mL 乙醚-二氯甲烷-正己烷（1∶10∶89，V/V）溶液洗脱，收集洗脱液为甘油三酯，并用氮气吹干。

将收集到的甘油三酯、磷脂分别溶解于1.5 mL 正己烷溶液后，进行碱法甲酯化[14]。气相色谱法测定两者的脂肪酸组成。气相色谱法条件：CPSil 88 熔融石英毛细管柱（100 m×0.25 mm×0.2 μm，美国Agilent 公司）。载气为氢气，燃烧气为氢气、氮气和空气。FID 温度为250 ℃，进样口温度为250 ℃。升温程序：45 ℃保持4 min，以13 ℃/min的速率升至175 ℃，保持27 min，再以4 ℃/min 升至215 ℃，保持35 min；进样量：0.3 μL，不分流。脂肪酸的百分含量采用面积归一化法确定（以峰面积的百分比表示）。

1.3 统计学分析

2 结果与分析

2.1 摄食不同脂质对大鼠体重及肝脏质量的影响

大鼠体重及肝脏质量见表3。由表3可知，各组大鼠的摄食量、初始体重无显著差异（P>0.05）。试验结束时，各组间大鼠的最终体重、体重增加量与增长率虽无统计学差异（P>0.05），但是在4 个组中，对照组大鼠有最小的体重增长率（57.70%），其次为MCT 和MLCT 组，体重增长率分别为（59.35±5.56）%和（62.82±6.25）%，HORO 组有最大的体重增长率（63.55±3.53）%。说明MCT和MLCT 具有降低大鼠体重的趋势。与对照组相比，只有HORO 组大鼠的肝脏质量有显著性升高（P<0.05），且显著性高于MLCT 和MCT 组（P<0.05）。

表3 摄食不同脂质对SD 大鼠体重及肝脏质量的影响（n=8）Table 3 Effects of feeding different lipids on body weight and liver weight of SD rats（n=8）

2.2 摄食不同脂质对大鼠血脂的影响

大鼠血脂的变化见表4。由表可知，MLCT 组大鼠血浆中TG、TC 浓度为各试验组中最低，而HORO 组具有最高的TG、TC 浓度，两组间有显著差异（P<0.05）。4 组动物血浆中HDL-C 含量无显著差异，但HORO 组HDL-C 的浓度最低。与对照组相比，3 个试验组的大鼠血浆中LDL-C 含量均有一定程度升高，其中，HORO 组LDL-C 含量显著高于对照组（P<0.05）。3 种脂质的摄入均显著降低了HDL-C/LDL-C 比值（P<0.05），其中，HORO组的HDL-C/LDL-C 比值最低，为2.73±0.85。

表4 摄食不同脂质对SD 大鼠血浆中各指标的影响（n=8）Table 4 Effects of feeding different lipids on indexes in plasma of SD rats（n=8）

2.3 摄食不同脂质对大鼠肝脏中脂代谢指标的影响

大鼠肝脏中脂代谢指标见表5。由表5可知，与对照组和HORO 组相比，MLCT 和MCT 组SD大鼠肝脏中TC 含量均有显著性降低（P<0.05）；TG 含量虽有降低的趋势，但无显著性差异（P>0.05）。

表5 摄食不同脂质对SD 大鼠肝脏中脂代谢指标的影响（n=8）Table 5 Effects of feeding different lipids on indexes of lipid metabolism in livers of SD rats（n=8）

MLCT 和MCT 组大鼠肝脏中的Apo A1 含量均显著性高于HORO 组（P<0.05），但与对照组无显著差异。MLCT 和MCT 也升高了Apo B 含量，特别是MLCT 组Apo B 含量显著高于HORO 组和对照组（P<0.05）。计算各组Apo A1/Apo B 比值可以发现，MLCT 和MCT 组的Apo A1/Apo B 比值显著高于HORO 组（P<0.05）。

2.4 摄食不同脂质对大鼠肝脏甘油三酯、磷脂脂肪酸组成的影响

各组大鼠肝脏中甘油三酯（TG）脂肪酸变化如表6所示。与对照组和MCT 组相比，MLCT 组和HORO 组的6c/9c-C18：1、9c12c-C18：2和C18：3n-3相 对含量都有显著性升高（P<0.05），导致这两组的不饱和脂肪酸（unsaturated fatty acid，USFA）含量和单不饱和脂肪酸（monounsaturated fatty acid，MUFA）都显著升高（P<0.05）。同时，MLCT 组和MCT组C8：0和C10：0相对含量显著高于对照组和HORO组（P<0.05）。

表6 SD 大鼠肝脏中甘油三酯脂肪酸组成（n=8）Table 6 Fatty acid compositions of triacylglycerols in livers of SD rats（n=8）

表7所示为各组大鼠肝脏中磷脂（PL）脂肪酸组成。可以看出，4 组大鼠肝脏磷脂中均未检测出C8：0、C10：0。相比对照组，HORO 和MLCT 组6c/9c-C18：1、9c12c-C18：2相对含量均有显著上升（P<0.05）；而3 个试验组中C20：4n-6（Arachidonic acid，ARA）和C22：6n-3（Docosahexaenoic acid，DHA）的相对含量显著高于对照组（P<0.05），且MCT 组的ARA 相对含量明显高于HORO 组和MLCT 组（P<0.05）。HORO 组和MLCT 组的USFA 和MUFA 相对含量显著性高于对照组和MCT 组（P<0.05）。且3 个试验组的多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）相对含量均显著高于对照组（P<0.05）。

表7 SD 大鼠肝脏中磷脂脂肪酸组成（n=8）Table 7 Fatty acid compositions of phospholipids in livers of SD rats（n=8）

（续表7）

2.5 摄食不同脂质对大鼠肝脏中脂代谢相关酶的影响

如表8所示，MCT 组大鼠肝脏中脂肪动员相关酶HSL、PKA 和cAMP 水平均为4 组中最高，而ATGL 水平为各组中最低，且显著低于HORO 组（P<0.05）。相反，在4 组中，HORO 组大鼠肝脏中HSL、cAMP 和PKA 水平均为最低，ATGL 水平在各组中为最高，且显著高于MCT 组（P<0.05）。MLCT 组 的HSL、PKA 和cAMP 水 平 均 高 于HORO 组水平，低于MCT 组水平；而MLCT 组的ATGL 水平高于MCT 组，但低于HORO 组。同时，MLCT 组的4 种脂质代谢相关酶水平均高于对照组。

表8 摄食不同脂质对SD 大鼠肝脏中脂质代谢相关酶的影响（n=8）Table 8 Effects of feeding different lipids on lipid metabolism related enzymes in livers of SD rats（n=8）

3 讨论

本研究结果显示，相比HORO 组，MLCT 组的SD 大鼠有着更小的体重增长率，说明MLCT 有抑制动物体重增长的趋势。以往的研究表明，MCFA比LCFA 更能增加机体能量消耗，从而更好地抑制体重增长、减少体内脂肪聚集[15-16]，与本研究结果基本一致。

机体脂代谢紊乱的最直观表现为血脂代谢指标上。本试验发现，MLCT 相较于HORO 有效抑制了血浆中TG、TC 及LDL-C 含量的升高，升高了HDL-C/LDL-C 比值。研究表明MCFA 在体内的利用效率显著高于LCFA，且不易在血中聚集，使血液中甘油三酯浓度维持在较低水平[17]。HORO 主要由LCFA 组成，而MLCT 中含有一定比例的辛酸（C8：0）和癸酸（C10：0），这导致了两者吸收代谢速率的差异。临床研究发现，血浆中TC、TG、LDL-C升高、HDL-C 降低会促进动脉粥样硬化的发生[18]。而MCFA 在防治代谢综合征方面具有良好的效果[19]。且同为饱和脂肪酸，MCFA 在维持机体胆固醇稳态方面优于LCFA。Xue 等[20]发现，MLCT 可降低高甘油三酯血症患者体重以及血清TG、LDLC，升高HDL-C，均表明MLCT 在改善血脂与预防肥胖相关疾病方面起到良好的作用。血液中脂代谢指标水平的高低也与脂质代谢的主要场所——肝脏密切相关[21]。血浆中脂质的变化通常预示着肝脏脂肪的代谢变化。在肝脏中，Apo A1、Apo B分别是高密度脂蛋白和低密度脂蛋白的主要载脂蛋白。Apo A1 有着调节脂代谢酶活性、促进脂类和胆固醇运输分解等作用，维持血脂水平正常，是肝硬化的重要指标[22-23]；Apo B 则与炎症反应和斑块形成有关。Apo A 水平下降、Apo B 水平升高是引发冠心病、动脉粥样硬化等疾病的危险因素[24]；一些研究提示，Apo A1/Apo B 比值在预测疾病风险方面比单个血脂指标更有价值[25-26]，Apo A1/Apo B 比值升高与心肌梗塞、Ⅱ型糖尿病及代谢综合征等疾病的发生均有关[27-29]。本研究结果显示，相比HORO，摄入MLCT 使肝脏中TC 含量显著减少，ApoA1 表达量显著升高，且Apo A1/Apo B 比值显著高于HORO 组，说明MLCT 不仅改善血脂，还减少了肝脏脂质的积累，加快肝脏组织对于多余脂质的清除，证明了MLCT 对动物脂代谢紊乱的改善作用稳定有效，具有预防肝脏和心血管损伤的潜力。

肝脏作为机体能量代谢与转换的重要器官，肝脏脂质的过量沉积会引起肝细胞功能紊乱，进而促进脂肪肝的形成，危害机体健康。因此，检测了肝脏中脂肪酸的组成变化。结果显示，相比对照组，MLCT 组大鼠的肝脏质量无明显增加，且MLCT 使肝脏中不饱和脂肪酸相对含量显著增加，有利于为机体提供必需脂肪酸，维持正常的生理代谢。必需脂肪酸是磷脂的重要组成部分[30]，也是合成多种类二十烷酸的前体物质[31]。Carlson 等[32]研究发现，在食用油中添加一定比例的MCT 在改善机体炎症反应的同时，不会降低肝脏中必需脂肪酸的含量。肝脏中脂质的积累与组成的改变也与脂质代谢相关酶水平息息相关。本研究证实MLCT 可上调大鼠肝脏中cAMP、PKA、ATGL 和HSL 水平。MLCT 组大鼠肝脏中TG、TC 含量的降低，可能与这些脂质动员相关酶的大量表达有关。HSL 广泛存在于动物体内的各个组织，其通过水解甘油三酯、产生游离脂肪酸为机体提供能量，在脂肪代谢过程中发挥着重要作用，与预防肥胖及胰岛素抵抗等有密切关联[33-34]。研究发现，ATGL也是甘油三酯水解第一步的关键限速酶。体外试验显示，当ATGL 的表达受到抑制时，机体组织中甘油三酯的分解显著减少，证明该酶在脂质代谢中的重要作用[35]。HSL 需要通过依赖cAMP 激活的PKA 磷酸化来获得更强的分解甘油三酯的能力，而ATGL 不依赖于激活的PKA[36]。试验结果表明，相较于HORO，含MCFA 的MLCT 可能主要通过cAMP-PKA 途径发挥作用。MLCT 在小肠中消化后，水解产生的MCFA 促进cAMP 的合成，刺激PKA 的表达量增加，从而促进HSL 的磷酸化。MLCT 可能在HSL 与ATGL 的双重作用下促进肝脏内脂肪水解。因此，本研究推测MLCT 促进脂质代谢的机制之一可能为MLCT 通过升高肝脏组织中脂肪动员相关酶水平来增加脂肪分解。

综上所述，含有MLCT 的饮食对预防动物肥胖、降低体脂与血脂具有积极作用。同时，MLCT还有助于控制肝脏脂肪增加，改善肝脏脂质代谢的作用。MLCT 有望作为新型的功能性食用油，用于预防肥胖和代谢紊乱。