牛肝菌多酚细胞抗氧化活性评价模型研究

王晶波，杨 倬，秦 文，王丽媛，陈 曦，卓 勤，宫照龙，沈 葹

寻找和开发安全性高、天然、无毒的抗氧化物质是近几十年来功能性食品研究的热点[1]。选择恰当准确的评价方法来评价其抗氧化活性至关重要。抗氧化活性评价方法主要包括体内动物试验、体外化学评价方法和细胞抗氧化评价方法。体内动物试验[2-3]是评价抗氧化活性较好的方法，然而，其成本高、周期长，不适于大批量样品的初筛操作；体外化学评价方法包括1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、2，2'-联氮双-（3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸）二胺盐（ABTS）和氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）等[4-8]，具有成本低、检测快、结果稳定等优点，然而，化学评价方法仅关注食物的抗氧化值，未考虑抗氧化成分在细胞内的生物利用率、吸收和代谢等情况，因此不能反映细胞生理条件和作用机制。

细胞抗氧化评价方法能够反映抗氧化物质在细胞内的吸收、代谢和分布等情况，相比于体内试验和体外化学评价方法，具有准确、用时少、成本低的特点[9]，是目前评价抗氧化物质的一种相对科学、合理的方法。Wolfe 等[10]建立的细胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）评价方法是以人体肝癌细胞HepG2 为试验模型，观察抗氧化物质在细胞中的反应情况，继其之后，许多研究小组建立了其它细胞模型（如Caco-2、AGS、RBC）[11-13]的抗氧化活性评价方法，丰富和创新了细胞抗氧化评价方法。同时，也有研究者发现不同的细胞模型适用于不同的抗氧化物质的活性检测[14]，因此，对细胞抗氧化评价方法的细胞模型的筛选是必不可少的。

牛肝菌是一种食药兼用的大型真菌，富含多酚、多糖、萜类[15-16]等抗氧化活性物质。目前评价牛肝菌多酚抗氧化活性的研究多集中在体外化学评价法。本文采用氧化自由基吸收能力和细胞抗氧化评价方法综合评价牛肝菌多酚的抗氧化活性，比较Caco-2、L02 和HepG2 3 种细胞模型检测多酚浓度范围、灵敏度方面的差异，确定能准确评价牛肝菌多酚抗氧化活性的细胞评价模型，为抗氧化物质的活性评价方法提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要样品、试剂与仪器

野生牛肝菌干货样品（市售）分别购自云南不同产地，将样品粉碎，过120 目筛后置阴凉干燥处备用。3 种牛肝菌名称（产地）分别为红牛肝菌（普洱）、黄牛肝菌（大姚）、黑牛肝菌（师宗），设为样品1～3 号。

Caco-2 和L02（编号为FH0029 和FH0099），上海富衡生物科技有限公司；HepG2（编号SCSP-510），上海生科院；MEM 和胎牛血清，HyClone 公司；1640 培养液、0.25%胰蛋白酶-EDTA，Gibco 公司；Cell Counting Kit-8 试剂盒（CCK-8 试剂盒），北京索莱宝科技有限公司。

没食子酸标准品（89.9%），中国食品药品检定院；槲皮素标准品（95%）、左旋抗坏血酸（SLBL9227V）、Folin-Ciocalteu 试剂、2’，7’-二氯荧光黄双乙酸盐（DCFH-DA）、2，2’-偶氮二异丁基咪二盐酸盐（AAPH）、碳酸钠、荧光素钠（FL），Sigma Aldrich 公司。

酶标仪SpectraMax i3x，基因有限公司；KQ-600DB 型数控超声波清洗器（功率600 W，频率40 000 Hz），昆山市超声仪器有限公司；CO2培养箱，Panasonic 公司。

1.2 牛肝菌多酚提取及含量测定

采用超声波提取法最佳工艺提取3 种牛肝菌多酚[15]。每种样品称取1 g 粉末，按照液料比为44∶1，加入85%的乙醇溶液，超声38 min 后4 500 r/min 离心15 min，吸取上清液并用85%乙醇溶液定容至50 mL，即为牛肝菌多酚提取液，于-20 ℃保存备用。采用Folin-Ciocalteu 比色法测定多酚含量，在96 孔板上分别加入30 μL 的多酚提取液样品、150 μL Folin-Ciocalteu 试剂（0.2 N）和120 μL 碳酸钠溶液（75 g/L），室温暗处反应2 h 后，在酶标仪于760 nm 下测定吸光度，以没食子酸（8.75，17.5，35，70，140 和280 μg/mL）为对照品绘制标准曲线，获取多酚含量以每克食用菌中没食子酸当量计。

1.3 氧化自由基吸收能力试验ORAC

本试验参考Huang 等[17]方法并加以改进。具体操作步骤为：首先向96 孔板中加入不同浓度样品、抗坏血酸标准品以及PBS（空白孔和阳性对照孔）25 μL，平行操作3 次，再向各孔加入150 μL FL 工作液，振荡5 s，37 ℃温育10 min。然后向各孔中迅速加入25 μL AAPH（除空白孔），以激发波长（485±20）nm、发射波长（530±20）nm 连续测定荧光强度，整个体系保持37 ℃，每1 min 测定1次荧光强度，每次测定前中速振动孔板10 s，振荡幅度4 mm，测定时间设定在荧光衰减呈基线后为止（本试验设置60 个循环），测定结果以ORAC 值表示。待测样品的ORAC 值以μmol/L 表示，即抗坏血酸当量。计算公式为：

式中：AUC样品——样品作用下的各微孔荧光衰退曲线下面积；AUC抗坏血酸——抗坏血酸作用下的荧光衰退曲线下面积；AUC对照——仅有AAPH作用下的荧光衰退曲线下面积；C抗坏血酸——标准品的浓度，μmol/L。

1.4 细胞培养

Caco-2 和HepG2 细胞采用MEM 培养基培养（胎牛血清量分别为15%和10%），L02 细胞采用含10%胎牛血清的1640 培养基，培养条件为37 ℃、5% CO2饱和湿度，当细胞生长至培养瓶底面积80%左右时传代，培养期间隔天换液，试验用细胞代数小于35 代。

1.5 细胞毒性试验

方法参照CCK-8 检测试剂盒说明。细胞于96 孔板上按照6×104个/孔接种，每孔加入100 μL 细胞液，37 ℃、5% CO2饱和湿度培养24 h，需留有无细胞孔做为空白孔。弃去培养液，用不含血清的培养液洗涤细胞2 次后加入100 μL 不含血清的培养液，再加入10 μL 不同浓度的牛肝菌多酚提取液，孵育24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，在培养箱内孵育1 h。用酶标仪测定在450 nm 处的吸光度。

式中：A样品——有细胞、CCK-8 溶液和样品溶液的孔的吸光度值；A空白——没有细胞、有CCK-8 溶液的孔的吸光度值；A对照——有细胞、CCK-8 溶液而没有样品溶液的孔的吸光度值。

细胞活力在90%以上为样品溶液无细胞毒性，样品浓度安全。

1.6 细胞抗氧化活性试验

细胞抗氧化活性试验过程和CAA 值计算方法参考文献[10、18]，并略有调整。细胞培养至足够数量，将对数生长期的细胞接种到96 孔板，每孔100 μL，每孔细胞数约为6×104个，于37 ℃、5%CO2条件下培养24 h 后，移去培养液，用PBS 清洗1 次后每孔加入100 μL 样品处理液（含DCFHDA，终浓度为 25 μmol/L）以及标准品槲皮素（终质量浓度为0，0.5，2.5，5，10，12，15，20，30，50 mg/L），平行3 孔，96 孔板周围孔弃用。37 ℃、5% CO2条件下培养1 h 后，弃去培养液，每孔加入100 μL 的600 μmol/L AAPH，用荧光酶标仪（激发波长538 nm、发射波长485 nm，恒温37 ℃）每5 min测定1 次荧光值，持续测定1 h。两步操作中，空白组用培养液处理，对照组用DCFH-DA 和AAPH处理，操作中使用的试剂均用无血清细胞培养液配制。

CAA 值计算：空白孔调零后，谱出荧光值随时间的变化曲线，由曲线下面积计算抗氧化物质的CAA 值。

式中：∫SA——样品时间-荧光值曲线下的积分面积；∫CA——对照时间-荧光值曲线下的积分面积。

样品的半数有效浓度（EC50）根据lg（fa/fu）对lg（样品浓度）的中效原理来计算，fa 表示样品作用效应（CAA unit），fu 表示100-CAA unit，EC50值以3 次平行试验计算得出。以每个96 孔板中测量的槲皮素作为标准，将牛肝菌多酚的CAA 计算为每100 g 牛肝菌的槲皮素（QE）微摩尔当量。使用Excel 处理数据，SPSS 软件分析EC50值，Origin 软件作图。

1.7 细胞抗氧化活性试验细胞种类的确定

采用1.6 节的方法，基于Caco-2、L02 和HepG2 3 种细胞来测定黄牛肝菌多酚的细胞抗氧化活性，比较三者在检测多酚浓度范围、灵敏度方面的差异，确定适宜牛肝菌多酚细胞抗氧化活性测定的细胞种类。采用适宜细胞测定红牛肝菌、黄牛肝菌和黑牛肝菌3 种牛肝菌多酚的细胞抗氧化活性，并与牛肝菌的多酚提取率、ORAC 进行相关性分析，验证方法的有效性和准确性。

2 结果与讨论

2.1 多酚含量和ORAC 测定结果

采用超声波提取法提取3 种牛肝菌多酚，并测定多酚提取率，结果见表1，标准曲线为y=0.0071x+0.0569，R2=0.9972。3 种牛肝菌之间多酚提取率差异不大，从高到低依次为黄牛肝菌、红牛肝菌和黑牛肝菌。牛肝菌氧化自由基吸收能力试验检测，以时间（min）为横坐标，荧光单位为纵坐标，绘制抗坏血酸标准溶液和不同种类牛肝菌多酚的荧光强度随时间衰减曲线，如图1所示。物质的抗氧化活性高者，荧光强度随时间衰减速度缓慢，从图1b 中可以看出黄牛肝菌多酚抗氧化活性最高，红牛肝菌和黑牛肝菌多酚次之，这与牛肝菌多酚提取率高低顺序一致。

图1 抗坏血酸标准品和不同种类牛肝菌多酚荧光强度随时间衰减曲线Fig.1 The decay curve of fluorescence intensity of ascorbic acid standard and boletus polyphenols with time

表1 3 种牛肝菌多酚提取率和ORAC 值测定结果Table 1 Results of the extraction rates of polyphenol and ORAC value of three varieties of boletus

2.2 细胞抗氧化活性试验的细胞筛选结果

细胞毒性试验证明牛肝菌多酚无细胞毒性。采用Caco-2、L02 和HepG2 3 种不同细胞模型来测定黄牛肝菌多酚的细胞抗氧化活性，计算得出QE 当量值分别为23.681，9.367，8.118 μmol QE·（100g）-1。如图2所示，3 种细胞都可以作为多酚细胞抗氧化活性测定模型的细胞基础，抗氧化活性均随着多酚浓度增大而升高，但不同细胞模型的抗氧化活性的检出限不同，Caco-2、L02 和HepG2 分别为0.025，0.1，0.2 g 黄牛肝菌提取的多酚，Caco-2 曲线的R2值（R2=0.9653）更接近1，Caco-2 细胞模型明显优于L02 和HepG2 模型，采用Caco-2 来测定牛肝菌多酚的细胞抗氧化活性，结果更灵敏与准确。

图2 基于3 种细胞模型的黄牛肝菌多酚的细胞抗氧化活性比较Fig.2 Comparison of cellular antioxidant activity of polyphenols from Boletus auripes based on 3 cell models

2.3 基于Caco-2 细胞的牛肝菌多酚细胞抗氧化能力试验结果

采用Caco-2 细胞模型测定3 种牛肝菌多酚的抗氧化能力，选取0.025，0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g 牛肝菌提取的多酚，由图3可知，牛肝菌多酚能有效抑制Caco-2 细胞中DCFH 向DCF 转化，随着多酚浓度的升高，细胞内荧光物质的生成减少，当多酚为0.5 g 牛肝菌提取时，细胞内荧光强度最低，即此时样品的细胞抗氧化能力最强。计算得出3 种牛肝菌多酚QE 当量的高低顺序与多酚含量和ORAC 值顺序一致，均为黄牛肝菌、红牛肝菌和黑牛肝菌，相关系数分别为0.9662 和0.9156，呈显著正相关，即多酚含量高的牛肝菌，其体外抗氧化能力和细胞抗氧化能力均较高（表2、表3）。

图3 牛肝菌多酚（b，c，d）和标准品槲皮素（a）抑制Caco-2 细胞中DCFH 向DCF 转化的动力学曲线（±s，n=3）Fig.3 The kinetic curve of the inhibition of the conversion of DCFH to DCF in Caco-2 cells by boletus polyphenols（b，c，d）and standard quercetin（a）（±s，n=3）

表2 牛肝菌多酚提取率、ORAC 值和CAA 值的检测结果Table 2 Results of the extraction rates of polyphenol and ORAC value and CAA value of boletus

表3 牛肝菌多酚提取率与细胞抗氧化活性相关性分析Table 3 Correlation analysis of polyphenol extraction rate and cellular antioxidant capacity from boletus

3 结论

抗氧化活性评价方法多种多样，采用细胞抗氧化评价方法具有准确、用时少、成本低的特点，同时也能满足样品高通量测定要求，研究者需根据研究样品来确定不同的细胞抗氧化研究模型，Caco-2、L02 和HepG2 3 种细胞相比较，Caco-2细胞模型更适用于牛肝菌多酚细胞抗氧化活性检测，并且可以与ORAC 等体外化学评价方法联合评价牛肝菌多酚的抗氧化活性。

牛肝菌多酚抗氧化活性强，黄牛肝菌ORAC值高达223.68 μmol AEAC/g，CAA 值达到23.68 μmol QE/100 g，不同种类牛肝菌多酚抗氧化活性高低不同，这为食品加工原料时选择适宜品种提供参考，也为牛肝菌作为营养性、功能性的菌类食品的研发提供了理论依据。