发酵肉制品中生物活性肽的研究进展

王宝丽，张开屏，刘嘉琪，张慧敏，李少英，靳 烨，田建军*

发酵肉制品是在自然或人工控制条件下，利用微生物的发酵或酶的水解作用使原料肉发生一系列生物化学及物理变化，从而形成风味、色泽和质地独特且具有较长保藏期的肉制品。发酵肉制品历史悠久，2 000 多年前位于地中海地区的古罗马人就通过自然发酵、成熟、干燥生产出发酵香肠[1]。目前，世界上发酵肉制品主要为火腿、培根和香肠等3 大类。我国著名的传统发酵肉制品有金华火腿、宣威火腿、牛干巴、广式香肠和川式腊肉等[2-3]。生物活性肽是具有一定的营养价值，还可在生物体内发挥特定生理功能的多肽类有机物。大多数已知的生物活性肽通常含有2～20 个氨基酸残基，并以特定的序列连接[4]。近几十年来，在制药工程、临床治疗、功能食品的研发或营养组学等方面，生物活性肽正在被广泛应用。目前，化学合成的生物活性肽被用于治疗心血管、胃、肠道、肥胖或肿瘤等疾病[5]。然而，经化学合成或修饰的功能肽虽兼具功能和经济效益，但其会在肾脏和肝脏等器官积累，导致许多严重的副作用。近年来，天然来源的生物活性肽是新的研究趋势[6]。

1950年，Mellander[7]发现了具有增强佝偻病患者骨钙化的功能酪蛋白磷酸化肽，这标志着食物源性的生物活性肽的发现。学者们发现，一些食源性的蛋白质包括动物蛋白、大豆蛋白、豌豆蛋白等，经生物酶法处理得到的肽类物质多具有如抗菌、抗癌、促进胰岛素分泌、免疫调节、抗高血压等生物活性功能[8-9]。在肉制品加工过程中，源于肌肉中内源酶和微生物酶的复合作用会使蛋白质发生强烈的水解作用而生成大量游离氨基酸（free amino acid，FAA）和分子质量各异的肽类化合物[10]。近年来，大量研究报道发酵肉制品特定的生产加工过程会产生具有多种功能的生物活性肽[11-12]。作为生物活性肽重要的食物来源，发酵肉制品中的生物活性肽成为近几十年的研究热点之一。本文综述发酵肉制品中生物活性肽的研究进展。

1 生物活性肽的来源

蛋白质是肉中最主要的成分，具有广泛的功能特性，可形成网络结构，可与水、盐等成分协同，在肉制品质地、感官与营养品质的形成中发挥重要作用[13]。肌球蛋白、肌动蛋白和胶原蛋白是肉中主要的结构性蛋白[14]。在肉制品发酵过程中，蛋白质会发生强烈的水解作用。蛋白质水解一般分为两个步骤：首先，内源肽酶（主要为组织蛋白酶和钙激活蛋白酶，溶酶体组织蛋白酶B 和D 被认为是导致发酵肉制品中第一次蛋白质分解的主要内肽酶）分解完整蛋白质生成小肽[15-16]；然后，生成的小肽被外源肽进一步降解使N-端和C-端释放单氨基酸、二肽或三肽[17]。

1.1 肌动蛋白的水解

肌动蛋白是肌原纤维中含量第二丰富的蛋白质，是发酵肉制品中生物活性肽的主要来源之一[18]。肌动蛋白的水解主要发生于9 段氨基酸序列中分别位于肌动蛋白的4 个二级子域（如图1）。大部分肽段水解于靠近N-端和C-端的序列1和序列9，序列1、3、4、5、9 位于第一子域（序列1部分位于第二子域）；序列2 位于第二子域，序列6 和8 位于第三子域；序列7 位于第四子域[19]。根据已知的组织蛋白酶B 裂解位点[20]，该酶可能在以下位点裂解肌动蛋白：Ala24-Gly25、Thr68-Leu69、Met49-Gly50、His75-Gly76、Gly76-Ile77、Lys86-Ile87、Thr105-Leu106、Thr251-Ile252、Lys330-Ile331和 Glu363-Tyr364；组织蛋白酶D 可能负责的裂解位点有：Cys12-Asp13、Thr79-Asn80、Thr91-Phe92、Thr91-Phe92、Lys120-Met121、Ile153-Val154、Leu155-Asp156、Lys240-Ser241、Trp358-Ile359、Thr91-Phe92、His103-Pro104、Lys120-Met121。但现无法确定是何种酶在Gly22-Phe23、Arg30-Ala31、Phe92-Tyr93、Arg97-Val98和Leu107-Thr108位点发生作用，因为这两种组织蛋白酶都有一些共同的裂解位点。氨基肽酶会对部分肽段再次水解。大部分氨基肽酶会在动物被屠宰后失去活性，但有5 种氨基肽酶在动物死后依然具有活性，即亮氨酸、精氨酸、丙氨酰、焦戊二酰和蛋氨酸氨基肽酶。在其作用下会生成Phe、Leu、Lys 和Met 等FAA。溶酶体羧肽酶A 和B 在酸性pH 值条件下具有最佳活性，前者可水解疏水性氨基酸，而后者则具有更广泛的水解活性[21]。二肽基肽酶（dipeptidyl peptidase，DPP）如DPPI、DPP II 和三肽基肽酶[22-23]，使肌动蛋白水解为二肽或三肽。此外，大部分学者认为钙激活酶不会水解肌动蛋白。

图1 肌动蛋白序列和3D 结构图[19]Fig.1 Picture of the actin sequence and 3D structure[19]

1.2 肌球蛋白的水解

肌球蛋白是肌原纤维的主要组成部分，与肌动蛋白、原肌球蛋白和肌钙蛋白一起参与肌肉收缩和各种非肌肉细胞运动。肌球蛋白分子是由两条完全相同重链（myosin heavy chain，MHC）和两组轻链（myosin light chain，MLC）组成的六聚体。源于肌球蛋白的生物活性肽主要由MHC 水解所得。暂时未有研究确定MHC 的全部氨基酸序列。Mora 等[24]在经24 个月腌制的伊比利亚干腌火腿中识别出部分水解于MHC 的肽段序列。Gallego等[25]利用nESI-LC-MS/MS 技术在经14 个月腌制的土耳其干腌火腿中识别出水解于MHC 的氧化肽氨基酸序列。在经9 个月腌制的西班牙干腌火腿中，已识别由组织蛋白酶B、H、L 水解MHC 所得主要肽段为Ser2-Arg18、Lys19-Ser37、Thr71-Asp90、Thr71-Asp86、Val72-Asp90 等，可确定MHC 是生物活性肽的重要来源之一。外肽酶继续水解小肽生成TS、TL、FD、VK、AT、QT 等二肽和SRE、TVQ、NAS、KIE、GKM 等三肽[26]。

1.3 肌浆蛋白的水解

肌浆蛋白系指肌浆中的蛋白质，主要包括肌红蛋白和参与肌肉收缩功能反应的酶蛋白，例如糖酵解酶系、三羧酸循环及脂肪酸β-氧化酶系、氧化磷酸化酶系、电子传递体有关的酶系等。有研究认为，在发酵肉制品中肌浆蛋白的水解程度高于肌原蛋白[27-28]。肌红蛋白（Myoglobin，Mb）是一种小分子蛋白，由珠蛋白与正铁血红素（Heme））结合而成。肌红蛋白的种类和含量决定着发酵肉制品的颜色[29]。通过研究接种乳酸菌发酵的猪肉制品，发现在原料肉中含有肌红蛋白，但在发酵后的样品中却没有发现肌红蛋白，证明在肉制品发酵过程中肌红蛋白会发生强烈的水解作用[30]。组织蛋白酶B、L 和μ-激钙酶参与肌酸激酶的水解，目前未见微生物酶参与这种蛋白质水解相关报道。

2 生物活性肽的功能

生物活性肽的定义为：蛋白质在酶解过程中产生的一些具有特殊生理调节功能的介于蛋白质和氨基酸之间的低分子聚合物，由20 种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线形、环形结构的肽类的总称。基于此认知，可将发酵肉制品中肽类物质分为营养性和功能性两类。而营养性肽是指具有与氨基酸和蛋白质相似的营养功能，而功能性肽是在神经系统和外分泌以及内分泌过程中发挥特定的信使功能，或者发挥抗氧化、提高免疫力等功能，功能性肽即为生物活性肽[31]。生物活性肽的活性取决于其结构，如氨基酸的组成、氨基酸在N-和C-端的类型、肽链的分子质量和长度、氨基酸的电荷特性、疏水性和亲水性、空间结构等[32]。

2.1 降血压生物活性肽

高血压是导致心血管疾病的主要危险因素之一。在全球范围内，心血管疾病的死亡率远高于癌症，是全球死亡率最高的疾病。预计到2025年，全球将有15.6 亿高血压患者。随着我国经济水平的发展，我国高血压患病率逐年升高[33-34]。血管紧张素转换酶（angiotensin converting enzyme，ACE）又称羧基-二肽基-金属肽酶，是肾活素血管紧张素系统（renin angiotensin system，RAS）的主要连接酶，参与周围血压的调节。它主要催化血管紧张素-Ⅰ转化为血管紧张素-Ⅱ，即将钝化的十肽转化为活跃的八肽血管收缩剂。此外，ACE 会钝化具有舒张血管功能的缓激肽。因此ACE 抑制剂具有降血压的功能[35]。大量研究表明，发酵肉制品中包含具有降高血压功能的生物活性肽-ACE 抑制剂[36]。由于其与血压调节的关系，可作为控制心血管疾病发生的重要因子，其抑制活性是发酵肉制品中研究最为广泛的生物活性肽之一[37-38]。在BIOPEP 数据库中，目前已知的3 285 个生物活性肽根据功能性可分为三类：降血压、抗氧化、抑菌，而降高血压生物活性肽占比高达21.6%[39]。

ACE 的抑制活性通过体外实验进行评估，用半抑制浓度IC50表示能够抑制ACE 50%活性的肽浓度，并模拟胃肠道环境对肽的体外生物利用度和生物活性进行评价。此外，需要进行体内实验，自发性高血压大鼠（spontaneously hypertensive rats，SHR）是公认的研究人类原发性高血压的动物模型。

因为生物活性肽的功能和结构具有相关性，通常具有较高ACE 抑制活性的肽在N-端含有芳香族或碱性氨基酸，在C-端则含有较多的疏水氨基酸和带正电的氨基酸。Pro、Arg、Phe、Tyr 和Lys是抗高血压活性肽中常见的氨基酸残基[40]。伊比利亚干腌火腿中肽段可在8 h 后将SHR 收缩压显著降低12 mmHg，对其序列进行分析表明2 632个AA 中包含已知的ACE 抑制片段PPK、PAP 和AAP，重复次数分别为322，302，119[41]。生物活性肽的ACE 抑制活性在体外和体内的实验结果不同，在体外实验中，RPR 的ACE 抑制性活性比KAPVA 低8 倍，但在体内实验中两者降血压活性相似。这可能是由于RPR 与底物有较高的亲和力，或者在ACE 抑制外还存在一种未知食源肽的降压机制。SHR 口服七肽FKGRYYP（IC50为0.55 μmol/L）后，血压却没有下降。这表明ACE 活性在体内也可能降低甚至消失。其原因可能是被细胞内肽酶、消化道酶或血清酶水解丧失活性，肝脏中的修饰作用也会降低功能肽活性[36]。除了通过ACE 抑制肽调控血压外，降高血压活性肽还可以通过其它途径调控血压。例如降高血压活性肽可以与RAS 系统中的肾素、精氨酸-一氧化氮途径、内皮素系统和Ca2+通道相互作用。最近的一些研究表明，食物源生物活性肽可以作为肾素抑制剂、钙通道阻断剂降血压，还可以调节交感神经系统，从而控制血压[42-44]。

2.2 抗氧化生物活性肽

抗氧肽是清除重金属、防止脂肪过氧化、降低细胞自氧化速率，并且能够有效捕获并中和自由基从而减少自由基对人体损害的一类活性物质，因其分子质量小、结构紧凑，可最大限度捕捉和消除过多的自由基及有害物质，抑制自由基的过氧化作用。发酵肉制品是抗氧化肽的天然来源之一。在BIOPEP 数据库目前已知的3 285 个肽段中，抗氧化生物活性肽占比为16.1%[39]。据报道，我国金华火腿和宣威火腿中均含有抗氧化活性肽。金华火腿中分离鉴定所得肽段GKFNV 是最主要的自由基清除剂[45]。四肽DLEE 是宣威火腿中具有抗氧化活性的功能性肽段，当其质量浓度为0.5 mg/mL 时，可清除75.45%的DPPH 自由基[46]。在金华火腿中已分离并鉴定不同的抗氧化肽，如DLEE、GKFNV 和LPGGGHGDL 序列[47]。Vastag 等[48]研究发现发酵香肠中的抗氧化性是原料中的2 或3倍，在经90 d 成熟期后，DPPH 自由基清除活性为50%、还原能力为0.97，而干燥18 h 后大于5 ku的肽段组分对DPPH 自由基的清除活性达到86%，而干燥72 h 后小于5 ku 的肽段其清除活性逐渐增加达到92%。有学者证明干发酵香肠中的小肽（<3 ku）对DPPH 自由基有较高的清除能力[24]。在发酵肉制品的加工生产过程中会发生氧化反应，脂肪的过度氧化会产生不良的酸败气味，蛋白质的氧化则会降低营养价值甚至危害人体健康[49-50]。发酵肉制品中的抗氧化肽也可以抑制脂肪和蛋白质的氧化提高其感官品质和营养价值。

2.3 其它功能

降血压和抗氧化是发酵肉制品中生物活性肽最主要的功能特性，此外其还具有抗菌、抗肿瘤、镇痛、调节免疫力、提高记忆力等功能。Castellano等[51]研究发现经10月腌制的西班牙干腌火腿中含有抑制李斯特菌的五肽RHGYM。Keska 等[52]研究发现经酸乳清腌制的发酵牛肉在4 ℃成熟1 个月后会释放大量生物活性肽，根据其功能性分类共有17 种生物活性（如表1～表3所示）。

表1 作用于心血管系统的主要肽段序列[52]Table 1 Main peptide sequences influencing the cardiovascular system[52]

（续表1）

表2 作用于免疫和神经系统的主要肽段序列[52]Table 2 Main peptide sequences influencing the immune and nervous system[52]

表3 具有其它活性的主要肽段序列[52]Table 3 Main peptide sequences with other activities[52]

（续表3）

3 发酵肉制品中生物活性肽的研究方法

生物活性肽在食品领域的研究因食物基质的复杂性，其提取分离方法也有很大差异。对于发酵肉制品中生物活性肽的研究首先需要将食物基质中的多肽进行提取，并通过一种或多种技术串联将多肽混合物进行逐级分离纯化，并利用质谱鉴定获得肽段氨基酸序列或结构，最后根据生物活性肽数据库的信息对其生理功能进行鉴定，必要时需进行体内实验。Jang 等[53]先后使用超滤、SephadexG-25 尺寸排阻色谱、PR-HPLC 的手段分离牛肉蛋白的水解物，获得了具有较强降血压活性的肽段VLAQYC；Wang 等[54]通过SephadexLH-20 尺寸排阻色谱与RP-HPLC 联用从牡蛎蛋白水解物中分离得到ACE 抑制肽段VVYPWTQRFO。

3.1 肽段的提取分离与鉴定

迄今为止，广大学者已熟练地采用各种方法提取食物源肽，例如溶剂提取法、微生物发酵法、蛋白酶水解法等。而对发酵肉制品中多肽的提取多采用溶剂提取法。国外学者多数参照Moral 等[41]的方法对发酵肉制品中的肽段进行提取，Korhonen 等[55]提出磷酸盐法提取。肽段粗提后需要通过紫外分光光度法测量其浓度；并进行脱盐处理且一般采用萃取法。SEC 是一种广泛用于肽段分离的色谱技术。在多肽分离中，固定相多为葡聚糖凝胶G25、流动相多为0.01N 的HCl。保留时间是分子尺寸的函数，可能提供一定的分子结构相关信息。生物相容性好，馏分活性回收率高。但它不能分辨分子大小相近的化合物，一般说来，分子质量的差别需在10%以上时才能分离，所以该法不能分离分子质量相近的肽段。肽段提取物分离纯化的方法还包括超滤法、离子交换层析、高效液相色谱法和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）等。

对肽段AA 组成和序列鉴定常采用液相色谱或质谱技术，并且大多将多种方法联用以获得更为准确的肽段结构信息，进而分析其中强活性的成分以及其结构中的有效特征。常用的有ESIMS、LC-MS、MALDI-TOF-MS 等[56]。光谱技术也广泛应用于肽段的结构分析中。

3.2 肽段生物学信息分析

生物活性肽是近年来的研究热点，广大学者在不断的研究和探索中发现了许多具有特定功能的生物活性肽并建立多种生物活性肽数据库。一般将试验所得的肽段序列结构与数据库中所有肽段序列结构相比较，根据肽段分子质量与数据库中所包含肽段理论分子质量相匹配的数量计算出试验肽段的生物活性评分。最为常用的数据库包括UniPot、BIOPEP、BLAST 等[58]。PeptideRanker 是一种既可以预测肽段的潜在生物活性，又可以计算活性片段在蛋白质序列中出现的频率（参数A）的数据库，生物活性评分为0～1 即无活性-活性最强[57]。此外EROP-Moscow、PEPBANK、ERP-Moscow等也常用于生物活性肽的活性分析。

4 结语与展望

发酵肉制品中的生物活性肽主要来源于肌原纤维和肌浆蛋白的内源酶水解作用。参与该水解的内源酶为组织蛋白酶B、D、H、L、K 和钙激活酶等，不同种内源酶的水解位点和最佳作用条件有所差异，组织蛋白酶B 和L 的最佳pH 值约为6，而组织蛋白酶H 的最佳pH 值为6.8，组织蛋白酶D 的最佳pH 值范围为3.0～5.0。然而，在发酵肉制品的实际生产过程中由于产品配方或加工条件的差异影响参与蛋白质水解的相关酶的活力，因此在不同种类的发酵肉制品中水解所得的生物活性肽种类可能会有一定差异[58]。

生物活性肽作为一种生物活性物质，需要保持其特定结构的完整性才可发挥其生理功能。有研究证明生物活性肽在经人体唾液、胃酸、有蛋白酶参与的胃肠道消化后会使生物活性肽发生降解，生理功能会下降甚至丧失[59]。已报道的对发酵肉制品中生物活性肽的研究主要是对发酵肉制品中的生物活性肽提取分离后再对其功能活性进行研究，然而直接食用发酵肉制品后，其中的生物活性肽是否会因复杂且特殊的生理环境而产生其它作用尚不清楚。发酵肉制品作为食物源性生物活性肽重要的来源之一可作为功能性食品的一个新方向，发酵肉制品中的生物活性肽依然有着很大的研究空间。未来对于发酵肉制品中生物活性肽的发展可以从以下三个方面考虑：1）建立发酵肉制品中生物活性肽数据库；2）探索出既有经济效益又有生理作用的发酵肉制品生产加工工艺以实现产业化；3）研发新型发酵剂或蛋白水解酶参与发酵肉制品生产，提高生物活性肽的含量和种类。